糖基化終產(chǎn)物對(duì)心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的影響.pdf

1、晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycaton end products，AGEs)是人體內(nèi)的糖類（如葡萄糖）和蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)的游離氨基端通過一系列復(fù)雜的非酶促反應(yīng)形成的結(jié)構(gòu)多樣的不可逆聚合物，加速了多種生物學(xué)進(jìn)程，如糖尿病，炎癥反應(yīng)，腎衰竭和老齡化?？固腔K產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycationendproducts，RAGE)是細(xì)胞膜上識(shí)別糖基化產(chǎn)物的特異性受體，并在包括心臟的多種器官

2、中表達(dá)。多種病程中糖基化產(chǎn)終產(chǎn)物和糖基化終產(chǎn)物受體的結(jié)合促發(fā)了氧化應(yīng)激種類，上調(diào)炎癥通路和RAGE介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的快速產(chǎn)生。近來研究表明心臟組織內(nèi)堆積的糖基化終產(chǎn)物和AGE-RAGE的相互作用是糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)理。并發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌病的一個(gè)顯著表現(xiàn)是心肌收縮功能的失調(diào)，但其發(fā)生機(jī)制還不清楚。
　　鈣在心肌細(xì)胞興奮收縮偶聯(lián)過程中發(fā)揮著最基本的作用。在哺乳動(dòng)物心臟中，促發(fā)心肌收縮的鈣主要來源于肌質(zhì)網(wǎng)。心肌收縮時(shí)，心肌細(xì)胞去極化，

3、細(xì)胞膜上電壓敏感的鈣通道被激活開放，細(xì)胞外鈣進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并激活肌質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣釋放鈣通道，使得肌質(zhì)網(wǎng)的丐庫釋放大量鈣轉(zhuǎn)到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，從而使胞質(zhì)內(nèi)自由鈣濃度快速升高而引發(fā)心肌收縮。
　　RyR是肌質(zhì)網(wǎng)膜上的一種鈣離子釋放通道，它是肌漿網(wǎng)上通過鈣誘導(dǎo)鈣釋放機(jī)制（Ca2+-induced-Ca2+-release，CICR）釋放鈣的門控。鈣火花是由4-6個(gè)相鄰的RyRs共同釋放鈣而發(fā)生的，是細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的基本單位，控制著肌質(zhì)網(wǎng)的鈣容量。舒張

4、期時(shí)，RyR的活性決定了隨機(jī)性鈣火花的發(fā)生。以往研究表明，RyR功能異常導(dǎo)致的心功能失常是引起多種疾病發(fā)生的原因，如局部缺血再灌注，心肌肥大和心衰。在心肌局部缺血中，超活躍的RyR2增強(qiáng)舒張期的鈣泄漏，參與室性心律失常、心肌梗死和左心室損傷中的心肌重構(gòu)。在心衰時(shí)，增強(qiáng)的肌質(zhì)網(wǎng)鈣泄漏使得SR鈣容量的部分耗竭，從而損傷心肌收縮功能及導(dǎo)致室性心律失常。
　　AGE-RAGE的相互作用通過減少收縮和舒張時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度及延長(zhǎng)鈣瞬變衰減

5、的時(shí)間而損害了心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)。眾所周知，RyR2因其表面富含自由巰基而被認(rèn)為是細(xì)胞氧化還原傳感器，通過加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)氧壓，可增強(qiáng)RyR的活性和肌漿網(wǎng)鈣的泄漏。因?yàn)锳GE/RAGE信號(hào)可引發(fā)氧自由基產(chǎn)物的產(chǎn)生，以此我們進(jìn)行假設(shè)，AGE/RAGE是通過增強(qiáng)RyR的活性，導(dǎo)致肌質(zhì)網(wǎng)鈣漏增加，從而損害心肌細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)。在本研究中，我們對(duì)AGE/RAGE引發(fā)心肌細(xì)胞膜上RyR活性增強(qiáng)的假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證。并進(jìn)一步闡述強(qiáng)活性的RyR調(diào)控肌質(zhì)網(wǎng)鈣漏，減少肌

6、質(zhì)網(wǎng)鈣庫容量，最終導(dǎo)致收縮時(shí)鈣瞬變減少的機(jī)制。
　　目的:晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)加速了糖尿病的發(fā)展，同時(shí)糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)在糖尿病心臟病的病程進(jìn)展中起到了重要的作用。本研究在于探討AGE/RAGE對(duì)大鼠心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)上RyR活性與鈣穩(wěn)態(tài)的影響，從而闡明糖尿病心肌病導(dǎo)致心功能失常的可能機(jī)制。
　　方法:南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供的SD乳鼠(2d)，用酶消化兩步法分離培養(yǎng)心肌乳鼠細(xì)胞，在本課題中，以乳鼠心肌細(xì)胞為研究

7、對(duì)象。并用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)，分別記錄鈣火花、鈣庫、鈣瞬變等鈣信號(hào)指標(biāo)。以觀察AGE對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞鈣信號(hào)的影響。
　　結(jié)果:1.結(jié)果顯示，與正常組比較，50μg/ml組AGE顯著的增加鈣火花的頻率1.6倍，150μg/ml組的AGE僅僅只增加了53％，同時(shí)AGE降低鈣火花的幅度與寬度。用抗體阻滯RAGE可以完全抑制由AGE刺激引發(fā)的鈣火花的發(fā)生.我們通過測(cè)量咖啡因(20rmM)誘導(dǎo)的鈣瞬變(△F/F0)幅度來評(píng)估鈣庫容量。令人驚

8、奇的是50μg/ml的AGE的刺激降低鈣庫容量是輕微的，而150μg/ml的AGE的刺激則能夠顯著的降低鈣庫容。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，在同時(shí)通過給予1HZ的場(chǎng)刺激情況下，50μg/ml的AGE的刺激對(duì)鈣瞬變的幅度沒有影響，相對(duì)比之下，150μg/ml的AGE的刺激能夠明顯降低鈣瞬變的幅度(△F/F0)。
　　2.抗RAGE抗體可以完全修復(fù)鈣庫容量和改善鈣瞬變。
　　3.AGE/RAGE增加細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生與增強(qiáng)RyR活性