晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中的自噬.pdf

1、目的：
　　 觀察晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation endproducts AGEs)對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞中自噬的誘導(dǎo)，并探討自噬在動(dòng)脈硬化內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用。
　　 方法：
　　 1.收集糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis AS)患者手術(shù)切除的頸動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，通過HE染色、熒光免疫染色并利用內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物vWF，標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞；通過透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及自

2、噬的發(fā)生；熒光免疫染色觀察自噬特異標(biāo)記物MAP1-LC3(microtubule-associated protein light chain3)的表達(dá)；觀察人頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中內(nèi)皮細(xì)胞的分布及自噬泡的形成。
　　 2.運(yùn)用不同濃度的糖基化-牛血清白蛋白(advanced glycation endproduct-bovineserum albumin AGE-BSA)作用不同時(shí)間來處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(human umbi

3、licalvein endothelial cells HUVECs)，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；MDC自噬囊泡染色；應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)自噬特異性標(biāo)識(shí)蛋白LC3-Ⅱ/β-actin及溶酶體相關(guān)膜蛋白Lampl的表達(dá)，并用熒光免疫標(biāo)記MAP1-LC3，以此評(píng)價(jià)AGE-BSA對(duì)HUVECs自噬水平的影響。
　　 3.自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素和抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine3-MA)干預(yù)后，應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率

4、；酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase LDH)含量，了解自噬對(duì)AGE-BSA造成的HUVECs損傷的影響。
　　 4.通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)基上清中活性氧物質(zhì)(reactive oxygenspeciesROS)含量；并用抗氧化劑維生素E(α-tocopherol)干預(yù)，以探討氧化應(yīng)激在AGE-BSA誘導(dǎo)自噬中的作用，進(jìn)一步探討自噬在AGE-BSA誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用。

5、　　 結(jié)果：
　　 1.通過HE染色及熒光免疫染色，我們發(fā)現(xiàn)，在糖尿病患者頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊纖維帽、內(nèi)膜結(jié)合區(qū)(即動(dòng)脈粥樣硬化肩部)以及脂質(zhì)壞死區(qū)邊緣有較多的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中MAP1-LC3表達(dá)較正常血管內(nèi)皮細(xì)胞增加。透射電鏡可觀察到新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中的大量自噬產(chǎn)生。
　　 2.MDC染色、熒光免疫細(xì)胞染色和透射電鏡結(jié)果均顯示AGE-BSA處理后可誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生自噬；免疫印跡技術(shù)結(jié)果顯示AGE

6、-BSA可上調(diào)HUVECs LC3-Ⅱ/β-actin、Lampl蛋白表達(dá)，且此作用在6 h達(dá)到高峰。同時(shí)自噬抑制劑3-MA能夠抑制AGE-BSA誘導(dǎo)的HUVECs自噬，而自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素能夠促進(jìn)HUVECs自噬的發(fā)生。
　　 3.AGE-BSA處理HUVECs6 h，抑制了細(xì)胞增殖，自噬抑制劑3-MA能夠明顯促進(jìn)AGE-BSA對(duì)細(xì)胞增殖的抑制，而自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素能夠緩解AGE-BSA對(duì)細(xì)胞增殖的抑制。AGE-BSA處理Hu

7、VECs后，造成LDH漏出率明顯增加，而自噬抑制劑3-MA能進(jìn)一步增加AGE-BSA誘導(dǎo)的細(xì)胞上清LDH的漏出，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素對(duì)AGE-BSA誘導(dǎo)的細(xì)胞上清LDH的漏出無影響。
　　 4.AGE-BSA處理能夠增加HUVECs胞內(nèi)活性氧(ROS)水平增加。抗氧化劑α-tocopherol不僅能夠降低AGE-BSA誘導(dǎo)的胞內(nèi)ROS水平，同時(shí)能抑制AGE-BSA誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ/β-actin表達(dá)上調(diào)。
　　 結(jié)論：