C反應(yīng)蛋白對人血管內(nèi)皮細(xì)胞晚期糖基化終產(chǎn)物受體表達(dá)的影響.pdf

1、[背景]：糖尿病血管并發(fā)癥包括動脈粥樣硬化和微循環(huán)功能損傷，是糖尿病患者致殘和死亡的主要原因。病人心血管病的發(fā)生率明顯高于一般人群，發(fā)病年齡明顯提前，這被稱為“加速型動脈粥樣硬化”。加速型動脈粥樣硬化的發(fā)生機制目前尚未完全闡明。研究表明：高度表達(dá)于糖尿病患者中的晚期糖基化終產(chǎn)物受體(ReceptorforAdvancedGlycationEnd-Products，RAGE)可能在導(dǎo)致內(nèi)皮活化和炎癥反應(yīng)，因而在加速動脈粥樣硬化進展中扮演重

2、要角色。在體外實驗中，RAGE對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有多種病理生理學(xué)效應(yīng)，包括使內(nèi)皮通透性增加、刺激內(nèi)皮細(xì)胞過度表達(dá)黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)及促炎癥介質(zhì)如單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的產(chǎn)生增多，從而加速動脈粥樣硬化發(fā)生。也有資料表明在糖尿病形成的動脈粥樣硬化斑塊中和閉塞性血管局部均可見RAGE的表達(dá)明顯升高。 C-反應(yīng)蛋白(C-ReactiveProtein，CRP)是人血清中常見的非抗體性蛋白質(zhì)量，在正常人體中微

3、量表達(dá)(約1μg/ml)。但是在一些感染、缺血和壞死等致病因素作用下，人體C-反應(yīng)蛋白水平可升高100倍以上，故CRP通常作為獨特的炎性標(biāo)記物來檢測炎癥反應(yīng)性疾病。臨床實驗證明：CRP在動脈粥樣硬化及糖尿病患者體內(nèi)均有不同程度的升高。近年來研究還發(fā)現(xiàn)：人體CRP水平的升高是動脈粥樣硬化發(fā)生的獨立危險因素，CRP還可以作為動脈粥樣硬化中炎癥活化因子，促進ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、內(nèi)皮素(ET)水平的升高，導(dǎo)致內(nèi)皮活化和單核巨

4、噬細(xì)胞聚集。正常人體中CRP是以5個單體結(jié)合形式存在。但有文章認(rèn)為，經(jīng)過構(gòu)型改變后單體CRP(MonomericCReactiveProtein，mCRP)才能與細(xì)胞表面受體結(jié)合，發(fā)揮其促炎癥的作用。 由于CRP介導(dǎo)和RAGE介導(dǎo)的炎癥下游因子相似，但兩者是否同時參與促炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生過程目前尚不清楚。我們利用體外培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞，研究CRP是否存在對RAGE的誘導(dǎo)作用。 [方法]：1.人隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)及

5、傳代培養(yǎng)；2.利用流式細(xì)胞技術(shù)及WesternBlot方法檢測內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)CRP刺激后RAGE蛋白的表達(dá)；3.利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測CRP對RAGE與AGEs結(jié)合的影響；4.利用RT-PCR和Real-TimePCR方法檢測內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)CRP刺激后RAGE的表達(dá)及CRP對RAGE轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)；5.利用RNA干擾技術(shù)阻斷內(nèi)皮細(xì)胞RAGEmRNA的生成，構(gòu)建RAGE表達(dá)缺失的細(xì)胞模型；6.利用ELISA方法檢測CRP對RAGE表達(dá)缺失的細(xì)胞促MC

6、P-1生成的作用。 [結(jié)果]：1.CRP增加內(nèi)皮細(xì)胞RAGE蛋白表達(dá)(WesternBlot和Flowcytometry法)1)不同濃度CRP刺激24小時對RAGE蛋白表達(dá)的影響與對照組相比，加入CRP5μg/ml即可見RAGE蛋白表達(dá)量增加(P＜0.05)，在CRP25μg/ml時RAGE蛋白表達(dá)增加更為明顯，CRP濃度為50μg/ml時RAGE蛋白表達(dá)量最大，隨后在CRP濃度為100μg/ml時表達(dá)量略有下降。2)50μg/

7、mlCRP作用不同時間對RAGE蛋白表達(dá)的影響CRP組RAGE蛋白的量均高于對照組(P＜0.05)。RAGE蛋白表達(dá)量在培養(yǎng)6小時即有增加，并在24～48小時達(dá)到最大值。 2.CRP對RAGE與其配體AGEs結(jié)合能力的影響Flowcytometry檢測表明：與對照組相比，50μg/mlCRP作用內(nèi)皮細(xì)胞24小時，能明顯增加細(xì)胞表面RAGE與AGEs的結(jié)合能力(P＜0.05)。 3.CRP上調(diào)RAGEmRNA表達(dá)(RT-P

8、CR法)1)不同濃度CRP刺激12小時對RAGEmRNA表達(dá)的影響加入CRP5μg/ml即可見RAGEmRNA表達(dá)量有所增加，CRP25μg/mlRAGEmRNA表達(dá)增加有顯著性，CRP濃度為50μg/ml時增加RAGEmRNA表達(dá)最大，隨后在濃度為100μg/ml時表達(dá)量略有下降。2)CRP作用不同時間對RAGEmRNA表達(dá)的影響將50μg/mlCRP加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)不同時間(0、6、12、24、48小時)，發(fā)現(xiàn)CRP組中目標(biāo)基因PC

9、R產(chǎn)量均高于對照組(P＜0.05)。RAGEmRNA表達(dá)量在培養(yǎng)6小時即有增加，并在12小時達(dá)到峰值，CRP作用24與48小時RAGE表達(dá)較12小時有所下降，但仍較對照組明顯增高。 4.CRP上調(diào)RAGEmRNA表達(dá)(Real-TimePCR法)1)CRP作用不同時間對RAGE蛋白表達(dá)的影響將50μg/mlCRP加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)不同時間(0、6、12、24、48小時)，發(fā)現(xiàn)CRP組中目標(biāo)基因表達(dá)明顯增高(P＜0.01)。RAGE

10、mRNA表達(dá)量在培養(yǎng)6小時即有增加，遞增至24小時達(dá)到峰值，CRP作用48小時組RAGE表達(dá)雖較24小時組明顯下降，但仍比對照組明顯增高。2)不同濃度CRP刺激24小時對RAGEmRNA表達(dá)的影響加入CRP5ug/ml即可見RAGEmRNA表達(dá)量顯著增加，25μg/mlCRP增加RAGEmRNA表達(dá)更為明顯，CRP濃度為50μg/ml時增加RAGEmRNA表達(dá)最大，隨后在濃度為100μg/ml時表達(dá)量稍有下降。 5.CRP提高R

11、AGEmRNA在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性利用Actinomycin-D阻斷細(xì)胞mRNA的生成，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)：對照組與50μg/mlCRP刺激6，12，24小時組相比無明顯差別，mRNA下降程度相似；但與CRP刺激48小時組比，對照組RAGEmRNA則明顯下降。 6.比較CRP與其單體mCRP對內(nèi)皮細(xì)胞RAGE表達(dá)的影響將50μg/mlCRP及mCRP加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)不同時間(0、6、24小時)，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測：與對照組相比

12、，mCRP組亦在6和24小時顯著升高目標(biāo)蛋白RAGE的表達(dá)，但與對應(yīng)時間的CRP組比較無明顯差異(P＞0.05)。 7.RNA干擾RAGE表達(dá)對CRP及LPS誘導(dǎo)MCP-1水平的影響利用RAGE特異的siRNA成功構(gòu)建RAGE缺失細(xì)胞模型。ELISA檢測培養(yǎng)液MCP-1水平。實驗發(fā)現(xiàn)：與空白對照組組相比，CRP(50μg/ml，24h)刺激組MCP-1水平明顯升高(P＜0.01)，僅經(jīng)過siRNA轉(zhuǎn)染組MCP-1水平顯著減低(P

13、＜0.01)，而siRNA加CRP刺激組水平與對照組差異沒有顯著性(P＞0.05)；LPS(1ng/ml，24h)刺激組與siRNA加LPS刺激組可以看到MCP-1水平的升高(P＜0.05)，但該兩組相互比較差異沒有顯著性(P＞0.05)。 [結(jié)論]：實驗結(jié)果提示RAGE作為一種在放大因素而存在于動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)中。CRP可以從蛋白和mRNA水平促進RAGE的表達(dá)，在一定程度內(nèi)呈濃度-時間效應(yīng)；并增加其與配體結(jié)合的能力，通