Moesin蛋白磷酸化在晚期糖基化終產(chǎn)物介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的:本研究試圖證明AGEs通過(guò)Moesin蛋白蘇氨酸磷酸化使其活化,進(jìn)而引發(fā)F-actin構(gòu)像的改變和內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的障礙,為進(jìn)一步闡明糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為其防治提供新的思路和有效的手段。
　　 方法:
　　 本課題以人皮膚微靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HMVEC及游離的SD大鼠皮膚微血管為研究對(duì)象,在細(xì)胞和組織兩個(gè)層面,應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)、免疫印記、siRNA干擾、RT-PCR、細(xì)胞免疫組化、單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性

2、的測(cè)定、游離微靜脈血管通透性的測(cè)定等方法,通過(guò)觀察AGEs刺激下Moesin蛋白表達(dá)和磷酸化水平和定位的變化,及其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞骨架形態(tài)、屏障功能和血管通透性的影響,闡明Moesin在AGEs介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能變化中的作用。AGE修飾的人血清白蛋白(AGE-modified human serum albuminAGE-HSA),由人血清白蛋白與葡萄糖共孵育8周制得。
　　 在細(xì)胞水平的研究中,人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞分別接種于1

3、00mm培養(yǎng)皿,微孔小皿(petridish)和鋪有1％明膠的雙層通透的培養(yǎng)皿(transwell)頂層小室微孔膜上(直徑6.5mm,孔徑大小0.4μm),待細(xì)胞長(zhǎng)至融合后,換無(wú)血清培養(yǎng)基2h使細(xì)胞獲得同步生長(zhǎng)。用不同濃度的AGE-HSA與細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)不同時(shí)間,并設(shè)立HSA陰性對(duì)照組進(jìn)行比較。在各實(shí)驗(yàn)處理組中,分別用可溶性RAGE的抗體(anti-RAGEIgG)、Rho激酶抑制劑(Y-27632)、p38抑制劑SB203580、

4、ERK通路抑制劑PD98059及JNK通路抑制劑SP600125,預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞；或用重組腺病毒MKK6b,p38α,p38β的無(wú)活性型突變體預(yù)轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞,均繼以AGE-HSA培養(yǎng)1h。采用westernblot技術(shù)檢測(cè)Moesin蛋白表達(dá)和磷酸化Moesin水平的變化,熒光染色法觀察細(xì)胞骨架蛋白的形態(tài)學(xué)改變,TRITC熒光標(biāo)記白蛋白漏出法測(cè)定單層內(nèi)皮細(xì)胞的通透系數(shù)Pα值,siRNA技術(shù)下調(diào)Moesin的表達(dá)。
　　 結(jié)果:<

5、br>　　 1.AGE-HSA可以時(shí)間劑量依賴方式引起游離微靜脈通透性的增高插管并測(cè)量基礎(chǔ)通透系數(shù)后,分別用不同濃度(12.5、25、50、100μg/ml)的AGE-HSA或100μg/ml的HSA灌流游離微靜脈120min,并每隔15～30min記錄一次通透系數(shù)。所得Pα值均與自身基礎(chǔ)Pα值相比較,并乘以100％?；A(chǔ)Pα設(shè)為100,即為每組的自身對(duì)照。結(jié)果顯示AGE-HSA作用于游離微靜脈可使其通透性隨時(shí)間延長(zhǎng)而增高。100μg

6、/ml的AGE-HSA使微靜脈通透性在30min時(shí)就與對(duì)照存在顯著性差異(P<0.05),并持續(xù)升高至120min。從45min起,50μg/ml的AGE-HSA也使微靜脈通透系數(shù)與對(duì)照有顯著性差異(P<0.05),并持續(xù)升高至120min。12.5和25μg/ml的AGE-HSA組的各時(shí)間點(diǎn)的通透系數(shù)與其自身對(duì)照相比均未產(chǎn)生明顯差異(P>0.05)。未經(jīng)修飾的HSA對(duì)微靜脈通透性無(wú)影響,各組與對(duì)照及組間的作用差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0

7、.05)。
　　 2.siRNA技術(shù)證明Moesin參與了AGEs介導(dǎo)的HMVEC形態(tài)和功能變化:
　　 (1)siRNA干擾技術(shù)抑制了Moesin及ERM蛋白在HMVEC的表達(dá):轉(zhuǎn)染MoesinsiRNA48h可顯著下調(diào)MoesinmRNA的表達(dá)水平,并使Moesin蛋白和ERM蛋白的表達(dá)與對(duì)照相比分別降為34±8％和38±9％。轉(zhuǎn)染controlsiRNA則無(wú)此作用。證明本實(shí)驗(yàn)所用的siRNA實(shí)驗(yàn)體系可以有效的下調(diào)M

8、oesin的表達(dá),并且證明在內(nèi)皮細(xì)胞中主要表達(dá)的ERM蛋白為Moesin。
　　 (2)干擾Moesin表達(dá)后可抑制AGE-HSA刺激引起的細(xì)胞功能和形態(tài)變化:轉(zhuǎn)染controlsiRNA和MoesinsiRNA的內(nèi)皮細(xì)胞,均顯示F-actin主要分布在細(xì)胞周邊,線條完整連續(xù),顯示出內(nèi)皮細(xì)胞的典型的鵝卵石樣輪廓。細(xì)胞間連接緊密,未見(jiàn)明顯縫隙形成。預(yù)轉(zhuǎn)染controlsiRNA的內(nèi)皮細(xì)胞,再繼以50μg/mlAGE-HSA作用1h

9、,F-actin外周致密帶邊緣變得毛糙不規(guī)整,出現(xiàn)鋸齒樣斷裂,趨于變細(xì)崩解消散,F-actin在胞漿內(nèi)彌散分布,形成由非極性單行排列的肌動(dòng)蛋白絲組成的應(yīng)力纖維。
　　 3.AGE-HSA時(shí)間和劑量依賴性地介導(dǎo)Moesin的磷酸化:
　　 (1)用westernblot的方法檢測(cè)AGE-HSA刺激后HMVEC胞漿內(nèi)Moesin蛋白表達(dá)和磷酸化Moesin(T558)水平的變化,發(fā)現(xiàn)50μg/mlAGE-HSA刺激后不同時(shí)間

10、(5、10、20、30、45、60、120min)Moesin蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變,而磷酸化Moesin于刺激后45min開(kāi)始增加,60～120min達(dá)高峰。
　　 (2)AGE-HSA可以時(shí)間劑量依賴的方式引起ERM蛋白的磷酸化,而對(duì)ERM蛋白的表達(dá)沒(méi)有影響。
　　 (3)siRNA干擾Moesin表達(dá)后,AGE-HSA刺激沒(méi)有使Moesin磷酸化增多:預(yù)先轉(zhuǎn)染MoesinsiRNA可顯著降低AGEs所誘導(dǎo)的Moesin

11、磷酸化水平的升高,而預(yù)轉(zhuǎn)染controlsiRNA則無(wú)此作用。
　　 4.AGE-HSA通過(guò)與RAGE結(jié)合介導(dǎo)Moesin磷酸化及內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙:
　　 (1)預(yù)孵育100μg/mlRAGE抗體1h,再給予50μg/mlAGE-HSA作用1h,結(jié)果顯示RAGE抗體可有效減少AGE-HSA所致Moesin磷酸化。
　　 (2)在組織水平,插管并記錄基礎(chǔ)通透系數(shù)后,用RAGEAb(50,100μg/ml)預(yù)灌流微靜

12、脈1h,記錄其通透系數(shù),沖洗并更換為含50μg/ml的AGE-HSA的灌流液繼續(xù)灌流1h,再次記錄通透系數(shù)。所得Pα值分別與其自身的基礎(chǔ)Pα值比較,得到相對(duì)Pα值。
　　 5.AGE-HSA可誘導(dǎo)ROCK和p38的磷酸化AGE-HSA可使磷酸化的ROCK和p38MAPK表達(dá)顯著增高,HSA則無(wú)此作用。且用MoesinsiRNA使Moesin表達(dá)減少,并不能抑制AGE-HSA誘導(dǎo)的ROCK磷酸化的增多,提示ROCK和p38MAPK

13、通路參與了AGEs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響,且ROCK是在Moesin的上游發(fā)揮作用。
　　 6.ROCK參與了AGE-HSA引起的Moesin磷酸化及內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙(1)預(yù)先加入ROCK抑制劑Y-27632(25μmol/L)30min,再給予50μg/mlAGE-HSA作用1h,可有效減少AGE-HSA所致Moesin蛋白磷酸化。
　　 (2)在組織水平,插管并記錄基礎(chǔ)通透系數(shù)后,用Y-27632(10,25μmol/

14、L)預(yù)灌流微靜脈30min,繼以含50μg/ml的AGE-HSA的灌流液繼續(xù)灌流1h,可使Pα值分別降至188.2±26.2％和165.7±30.2％,顯示出劑量依賴效應(yīng)(P<0.05)。抑制劑本身對(duì)血管通透性無(wú)影響。證明ROCK參與介導(dǎo)了AGE-HSA引起的Moesin磷酸化和對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。
　　 7.p38通路參與了AGE-HSA引起的Moesin磷酸化及內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙:
　　 (1)預(yù)先加入p38MAPK

15、抑制劑SB203580(25μmol/L)30min,再給予50μg/mlAGE-HSA作用1h,可有效減少AGE-HSA所致Moesin蛋白磷酸化。p38上游激酶MKK6b結(jié)構(gòu)活性型突變體的重組腺病毒MKK6b(E),在無(wú)外來(lái)刺激的情況下即可使Moesin磷酸化水平顯著增多；且MKK6b的無(wú)活性突變體MKK6b(A)可明顯抑制AGE-HSA對(duì)Moesin磷酸化的作用；p38α亞型的無(wú)活性突變體p38α(A)也可顯著抑制AGE-HSA對(duì)

16、Moesin磷酸化的作用,p38β(A)則無(wú)此作用；且p38α(A)與MKK6b(E)共轉(zhuǎn)染,可阻斷后者對(duì)Moesin磷酸化的作用,而p38β(A)則不可阻斷MKK6b(E)的作用。
　　 (2)在組織水平,預(yù)先給予SB203580(10,25μmol/L)可使相對(duì)Pα值分別降為195.7±42.4％和163.5±30.7％(P<0.05)并顯示出劑量依賴效應(yīng)。
　　 8.AGE-HSA作用后引起磷酸化Moesin在細(xì)胞

17、內(nèi)分布的改變?cè)诩す夤簿劢癸@微鏡下觀察,可見(jiàn)在正常內(nèi)皮細(xì)胞中,非磷酸化Moesin主要分布在胞漿區(qū)域。
　　 結(jié)論:
　　 1.AGE-HSA以時(shí)間和劑量依賴的方式引血管通透性的增高。
　　 2.AGE-HSA以時(shí)間和劑量依賴的方式引起磷酸化的Moesin、ERM蛋白表達(dá)增多。抑制Moesin蛋白的表達(dá),可顯著抑制AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,提示AGEs通過(guò)使Moesin蛋白磷酸化引起細(xì)胞骨架改變,進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮

18、細(xì)胞功能障礙。
　　 3.可溶性RAGE的抗體可阻抑AGEs誘導(dǎo)的Moesin磷酸化和血管通透性升高,提示AGE-RAGE的結(jié)合在轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)入細(xì)胞的過(guò)程中起重要作用。
　　 4.ROCK抑制劑可阻抑AGEs引起的Moesin磷酸化及內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,且阻止Moesin的表達(dá)并不能影響AGEs所引起的ROCK磷酸化增多,提示Rho激酶參與了這一病理過(guò)程,且位于Moesin蛋白的上游。
　　 5.p38MAPK參與了A