鐵在α-突觸核蛋白磷酸化中的作用及機制研究.pdf

1、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一種常見的多發(fā)于中老年的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病。主要臨床表現(xiàn)包括靜止性震顫、運動遲緩、肌僵直和姿勢步態(tài)障礙等。其主要病理改變?yōu)楹谫|（substantia nigra，SN）多巴胺（dopamine，DA）能神經元的變性死亡以及路易小體形成。目前，PD的確切病因仍未完全明了，包括遺傳因素、環(huán)境因素和老化因素。氧化應激、炎癥反應、線粒體功能障礙、凋亡、蛋白異常聚集、鐵的過度沉積等均可

2、能參與了 PD的發(fā)病過程。α-突觸核蛋白是PD特征性病理標志路易小體的主要成分，與家族性及散發(fā)性的PD有密切聯(lián)系，其異常聚集被認為是 PD發(fā)病的核心機制。α-突觸核蛋白的翻譯后修飾有多種形式，如磷酸化、泛素化、糖基化、硝基化等，其中蛋白質磷酸化是調節(jié)蛋白質功能最常見的，也是最重要的翻譯后修飾方式。在生理條件下，大鼠體內約有4％的α-突觸核蛋白處于第129位絲氨酸位點（Sl29）磷酸化狀態(tài)，但在路易小體中有90％的α-突觸核蛋白Sl29被

3、磷酸化。α-突觸核蛋白的磷酸化狀態(tài)很明顯可以影響其表達和聚集，磷酸化與α-突觸核蛋白的清除機制相關。一些研究顯示α-突觸核蛋白 Sl29磷酸化（pS129）促進包涵體形成，而另一些研究顯示磷酸化作為代償反應抑制包涵體形成或根本不起作用。因此，α-突觸核蛋白的磷酸化對于其表達和聚集起到促進還是抑制作用，尚未明確。尸檢表明，PD病人的黑質區(qū)鐵含量明顯上升，且黑質鐵的水平與PD的進程相關，鐵的過度沉積可能是 PD發(fā)病中的關鍵因素。異常增加的鐵

4、水平促進活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生從而對DA能神經元造成損傷。前期研究證實鐵可誘導α-突觸核蛋白的表達及聚集，但該過程是否與α-突觸核蛋白的磷酸化有關尚不明確。Polo樣激酶2（polo-like kinase2，PLK2）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能特異性地磷酸化α-突觸核蛋白S129。酪蛋白激酶2（casein kinase2，CK2）是一種常見的含兩個α或α’催化亞基與兩個β調節(jié)亞基的絲

5、氨酸/蘇氨酸激酶。鐵作用于α-突觸核蛋白的磷酸化過程中是否有這兩種激酶的參與也尚不明確。本研究在人神經母細胞瘤 SH-SY5Y細胞上，應用免疫印跡方法檢測了枸櫞酸鐵銨（ferric ammonium citrate，F(xiàn)AC）處理后，α-突觸核蛋白表達水平及磷酸化水平，PLK2和CK2表達水平，以及自噬標志物LC3表達變化。用蛋白酶體活性檢測試劑盒檢測 FAC對細胞內蛋白酶體活性的影響。用 PLK2的抑制劑 BI2536、CK2的抑制劑T

6、BCA以及抗氧化劑N-乙?；?L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）預處理后，檢測鐵對上述指標影響的變化，以闡明鐵在α-突觸核蛋白磷酸化中的作用及機制。
　　本研究主要內容包括：⑴1mmol/L FAC處理SH-SY5Y細胞4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、48 h，α-突觸核蛋白表達水平于12 h開始增加，1mmol/L FAC處理12 h~48 h后α-突觸核蛋白表達水平分別增加8

7、1%、90%、93%、66%、51%，與對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果提示，鐵能夠誘導α-突觸核蛋白表達隨時間變化逐漸上調，隨后表達上調的程度有所減弱。⑵1mmol/L FAC處理SH-SY5Y細胞4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、48 h，pS129表達水平于12 h開始增加，1mmol/L FAC處理12 h~48 h后pS129表達水平分別增加115%、127%、152%、106%、68%

8、，與對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。α-突觸核蛋白的磷酸化水平于16 h開始增加，1mmol/L FAC處理16 h~48 h后pS129與α-突觸核蛋白的比值分別增加42%、42%、47%、51%，與對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果提示，鐵能夠誘導α-突觸核蛋白的磷酸化水平隨時間變化逐漸上調。⑶1mmol/L FAC處理SH-SY5Y細胞4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、48 h，

9、PLK2表達于12 h開始增加，1mmol/L FAC處理12 h~48 h后PLK2表達水平分別增加33%、30%、53%、44%、35%，與對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；CK2表達于24 h開始增加，1mmol/L FAC處理24 h與48 h后CK2表達水平分別增加46%與48%，與對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果提示，鐵能夠誘導PLK2和CK2表達隨時間變化逐漸上調，PLK2表達上調的程度隨后有

10、所減弱，CK2的上調明顯晚于PLK2。⑷20μmol/L TBCA、1μmol/L BI2536、20μmol/L TBCA與1μmol/L BI2536分別預處理SH-SY5Y細胞30min后與1 mmol/L FAC共孵育24 h，α-突觸核蛋白表達水平分別降低43%、44%、41%，與FAC組相比，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；α-突觸核蛋白的磷酸化水平分別降低27%、31%、32%，與FAC組相比，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.

11、01）。結果提示，CK2和PLK2的抑制劑可阻斷高鐵誘導的α-突觸核蛋白的磷酸化水平及表達水平增加。⑸20μmol/L TBCA處理SH-SY5Y細胞24 h后，PLK2表達水平增加41%，與對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。1μmol/L BI2536處理SH-SY5Y細胞24 h后，與對照組相比，CK2表達水平沒有明顯變化。結果提示，細胞內CK2的活性變化會影響 PLK2的表達，作用于同一靶點的不同激酶之間存在相互影響。

12、⑹0.5 mmol/LNAC預處理SH-SY5Y細胞30min后與1 mmol/L FAC共孵育24 h，PLK2與CK2的蛋白表達水平以及α-突觸核蛋白的磷酸化水平回到正常，與FAC組相比，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。然而NAC和FAC共孵育24 h后α-突觸核蛋白表達水平仍比對照組高出32%，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果提示，抗氧化劑NAC能夠完全阻斷高鐵誘導的PLK2和CK2表達水平以及α-突觸核蛋白磷酸化水平上調

13、，僅部分阻斷高鐵誘導的α-突觸核蛋白表達上調。⑺1mmol/L FAC處理SH-SY5Y細胞24 h后，LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ比值和蛋白酶體活性分別增加147%和12%，與對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。0.5 mmol/L NAC預處理SH-SY5Y細胞30min后與1 mmol/L FAC共孵育24 h，LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值下調22%，與FAC組相比，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；蛋白酶體活性與FAC組相比下調5