Tudor-SN蛋白磷酸化對其參與應激顆粒形成的機制研究.pdf

1、研究目的：細胞應激是細胞處在不利生存條件下所采取的保護性的應答方式，細胞應激也分為多種，比如氧化應激，病毒感染，缺氧應激等等，對于不同的應激，細胞內(nèi)會有不同的信號通路應答相對應的應激刺激，其中應激顆粒（SGs）的形成是細胞應激過程中一個重要方面。Tudor-SN蛋白作為一種多功能蛋白，在細胞應激過程中發(fā)揮著重要的作用，例如在植物中，Tudor-SN蛋白可以提高植物的應激耐受力，并可穩(wěn)定敏感的mRNA的水平，對于植物在高鹽、高滲的環(huán)境下生

2、長至關重要。近年來陸續(xù)有文獻報道，Tudor-SN蛋白可以參與應激顆粒的形成，并起到抗凋亡、促進細胞存活的作用。本課題旨在通過對 Tudor-SN蛋白的關鍵性磷酸化位點在其參與應激顆粒形成過程中作用的研究，進而深入探討其在應激過程中發(fā)揮的重要作用。
　　方法：本課題分為三個部分，第一部分是構建pCMV-N-Tudor-SN(T103A)-Flag、pmCherry-C1-Tudor-SN(T103A)兩種點突變質粒，首先通過定點突

3、變技術將 T hr103(T103)位點進行突變，然后利用質粒構建技術，將目的片段與載體相連接，該兩種質?？梢詾楹罄m(xù)的CoIP及免疫熒光實驗提供必要的實驗基礎。第二部分是T103點突變對Tudor-SN蛋白參與應激顆粒形成的影響。這部分分為三個方面，第一方面利用重組質粒，觀察T103點突變后對Tudor-SN蛋白與應激顆粒共定位的影響。第二方面，利用CoIP技術，研究點突變情況下，Tudor-SN蛋白與應激顆粒蛋白組分的結合情況。第三方

4、面，利用 RIP技術，研究點突變情況下，Tudor-SN蛋白與應激顆粒mRNA組分結合的情況。第三部分是應激條件下磷酸化 Tudor-SN蛋白的上游激酶分析。此部分分為四個方面。第一方面， Tudor-SN蛋白 T103位點潛在激酶生物信息學預測。利用磷酸化數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站對Tudor-SN蛋白的潛在激酶進行預測。第二方面，Tudor-SN蛋白與潛在激酶的結合檢測。利用 CoIP技術檢測 Tudor-SN蛋白與一些潛在激酶的結合情況。第三方面

5、，Tudor-SN蛋白潛在激酶的驗證。利用體外激酶檢測技術，確定能夠直接磷酸化 Tudor-SN蛋白 T103位點的激酶。第四方面，抑制 JNK激酶活性對Tudor-SN磷酸化水平及其參與應激顆粒形成的影響。給予JNK抑制劑的情況下，利用Western blot技術檢測T103位點磷酸化程度的變化，利用免疫熒光技術檢測Tudor-SN蛋白與應激顆粒的共定位情況。
　　結果：
　?、賰煞N質粒 pCMV-N-Tudor-SN(T

6、103A)-Flag、pmCherry-C1-Tudor-SN(T103A)能夠在細胞中融合表達，證明質粒構建成功，可以用于后續(xù)實驗。
　?、赥udor-SN蛋白T103位點突變后，其不能與應激顆粒共定位。
　　③CoIP實驗結果顯示，T103位點突變可導致其與顆粒組分蛋白G3BP、TIAR的結合減弱。
　?、躌IP結果顯示， T103位點突變沒有影響其與應激顆粒 mRNA組分AGTR1-3'UTR的影響。
　　

7、⑤Tudor-SN蛋白與其潛在磷酸化激酶JNK有結合，和激酶p38沒有結合。
　?、藜せ畹腏NK可以直接磷酸化Tudor-SN蛋白的T103位點。
　?、呓o予JNK抑制劑，可以使T103位點的磷酸化水平下降，且定位于應激顆粒的T103位點磷酸化的Tudor-SN蛋白明顯減少。
　　結論：
　?、僭趤喩樗猁}刺激條件下，Tudor-SN蛋白T103位點磷酸化是其能夠進入應激顆粒的先決條件。
　?、赥udor-S