PINK1蛋白磷酸化修飾帕金森病發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、背景：帕金森病(Parkinson's disease，PD)是臨床上常見的神經(jīng)退行性疾病之一。PD的臨床表現(xiàn)主要為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、步態(tài)異常和肌強(qiáng)直，PD的病因與發(fā)病機(jī)制尚無確切定論，主流研究認(rèn)為這是一種與衰老、環(huán)境及遺傳因素密切相關(guān)的疾病。PINK1基因(PTEN-induced putative kinase1)是在2004年被克隆的PARK6致病基因，屬于常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森綜合征的致病基因之一，該基因編碼產(chǎn)生一種由

2、581個(gè)氨基酸組成有激酶活性的線粒體蛋白，包括一個(gè)由34個(gè)氨基酸組成的線粒體定位結(jié)構(gòu)域和一個(gè)由354個(gè)氨基酸組成的激酶結(jié)構(gòu)域，此激酶結(jié)構(gòu)域與Ca2+/鈣調(diào)蛋白家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶高度同源。PINK1蛋自首先于2003年被證明它的激酶區(qū)域在體外實(shí)驗(yàn)中有自磷酸化活性，PINK1蛋白能通過自身磷酸化后，調(diào)節(jié)其自身的激酶活性;PINK1蛋白也能參與體外磷酸化，如磷酸化組蛋白H1或酪蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)PINK1基因的致病突變影響了PINK1蛋白

3、的磷酸化。但未有PINK1蛋白自身磷酸化位點(diǎn)體外實(shí)驗(yàn)的鑒定研究報(bào)道，及PINK1蛋白的自身磷酸化修飾位點(diǎn)改變對(duì)其體外激酶活性影響研究報(bào)道。在前期工作中我們發(fā)現(xiàn)了兩種PINK1基因新的純合致病突變(T313M，R492X)，兩者均位于激酶結(jié)構(gòu)域中，從而導(dǎo)致其激酶功能改變，也可能對(duì)穩(wěn)定PINK1蛋白的結(jié)構(gòu)起重要作用，這兩種致病突變的致病機(jī)理仍有待探討。
　　目的：探討PINK1蛋白自磷酸化修飾功能及磷酸化底物功能參與帕金森病致病的機(jī)制

4、
　　方法：⑴應(yīng)用谷胱甘肽親和層析法純化法、體外磷酸化和質(zhì)譜技術(shù)鑒定PINK1蛋白的自身磷酸化修飾位點(diǎn);⑵應(yīng)用體外磷酸化和放射自顯影技術(shù)明確PINK1蛋白的自磷酸化修飾位點(diǎn);⑶應(yīng)用體外磷酸化和放射自顯影技術(shù)檢測PINK1的自磷酸化修飾位點(diǎn)突變、T313M、R492X突變對(duì)PINK1蛋白的激酶活性的影響;⑷應(yīng)用脂質(zhì)體過表達(dá)、細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色的方法檢測自磷酸化修飾位點(diǎn)對(duì)PINK1在真核細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位的影響;⑸應(yīng)用脂質(zhì)體過表達(dá)、

5、chase-time技術(shù)研究自磷酸化位點(diǎn)突變對(duì)PINK1自身降解的影響;⑹應(yīng)用脂質(zhì)體過表達(dá)、細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色的方法檢測PINK1自磷酸化修飾位點(diǎn)突變、T313M、R492X突變PINK1對(duì)Parkin亞細(xì)胞定位的影響。
　　結(jié)果：①質(zhì)譜結(jié)果顯示一個(gè)PINK1蛋白可能的自身磷酸化位點(diǎn):PINK1第465位絲氨酸殘基-Ser465，通過生物信息比對(duì)可知，該氨基酸殘基在絕大多數(shù)種屬中高度保守。②放射自顯影結(jié)果示:在體外磷酸化條件下，

6、野生型PINK1蛋白能夠被自身磷酸化，而S465A突變型PINK1蛋白自身磷酸化水平較野生型降低，兩者的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。③放射自顯影結(jié)果示:在體外磷酸化條件下，野生型PINK1蛋白能夠磷酸化酪蛋白(casein)，而T313M、R492X、S465A突變型PINK1蛋白磷酸化底物水平較野生型降低，三種突變型PINK1蛋白分別與野生型PINK1蛋白進(jìn)行兩兩比較的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。④HEK293細(xì)胞免

7、疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示:野生型PINK1蛋白分布于細(xì)胞胞質(zhì)，呈典型的點(diǎn)狀分布的線粒體定位;而S465A、S465D突變型PINK1蛋白的亞細(xì)胞定位沒有明顯變化，仍呈胞漿中線粒體定位。⑤Chase-time實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:S465A、S465D突變型PINK1蛋白降解的半衰期較野生型延長，降解減慢。⑥HEK293細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示:野生型PINK1蛋白和S465D突變型PINK1蛋白均促進(jìn)Parkin蛋白轉(zhuǎn)移到聚集的線粒體上，S4

8、65A、T313M、R492X突變型PINK1蛋白促進(jìn)此過程的效率明顯下降。
　　結(jié)論：⑴PINK1蛋白第465位絲氨酸殘基Ser465為其體外自磷酸化的位點(diǎn)之一;⑵PINK1蛋白第465位絲氨酸殘基Ser465突變、PINK1致病突變T313M、R492X均能引起PINK1體外磷酸化激酶活性降低;⑶PINK1蛋白第465位絲氨酸殘基Ser465對(duì)PINK1蛋白真核細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞定位無影響;⑷PINK1蛋白第465位絲氨酸殘基Ser