α-synuclein絲氨酸磷酸化和分子交聯(lián)與帕金森病病因的關(guān)系研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其特征性病理學(xué)表現(xiàn)是選擇性黑質(zhì)密質(zhì)部(pars compacta of the substantia nigra，SNpc)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性缺失和殘存的多巴胺能神經(jīng)元中出現(xiàn)路易氏小體(Lewy bodies，LBs)。免疫病理學(xué)發(fā)現(xiàn)Lewy體內(nèi)主要組成成分是可溶性突觸核蛋白(α-Synuclein)聚集形成的不溶性纖維聚集物。
　　 目前

2、關(guān)于PD的病因存在多種學(xué)說，其中氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、興奮性氨基酸毒性、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)毒物等學(xué)說都得到了一定的證明，這些因素相互作用形成惡性循環(huán)，最后導(dǎo)致對(duì)環(huán)境刺激敏感的腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、缺失。在對(duì)PD的病因?qū)W研究中，α-Synuclein所起到的作用也越來越引起人們的重視。α-Synuclein是構(gòu)成Lewy體的主要成分，目前認(rèn)為：功能性的α-Synuclein在某些因素的作用下發(fā)生分子構(gòu)象改變，功能出現(xiàn)異常，并阻止了細(xì)

3、胞對(duì)它的清除，出現(xiàn)α-Synuclein聚集，導(dǎo)致了Lewy體形成以及產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。因此針對(duì)促使α-Synuclein出現(xiàn)異常聚集因素的研究成為了如今PD病因?qū)W研究的熱點(diǎn)。
　　 在對(duì)PD病人的病理學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，無論是家族性還是散發(fā)性病例，其黑質(zhì)致密部位多巴胺能神經(jīng)元中α-Synuclein的絲氨酸磷酸化程度都很高，盡管人類的α-synuclein有9，42，87和129等四個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，但是α-Synuclein的絲

4、氨酸磷酸化的主要部位是129位點(diǎn)。各種外界刺激如百草枯、魚藤酮以及1-甲基-4苯基-1,2,3,6-MPTP等環(huán)境毒物都可以引起129位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)α-synuclein129位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化具有促進(jìn)胞漿內(nèi)蛋白聚集體形成的作用。但是也有相反的結(jié)論認(rèn)為129位點(diǎn)絲氨酸磷酸化可以阻止α-synuclein的聚集，或者對(duì)α-synuclein的聚集沒有影響。雖然不同的細(xì)胞模型可能是造成結(jié)果迥異的原因，但是人們由此也推想，

5、可能細(xì)胞內(nèi)存在某種因素做為聚集的催化劑或交聯(lián)劑，促使磷酸化的α-synuclein發(fā)生聚集。
　　 組織型谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(tissue transglutaminase，tTG)是谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶家族(Transglutaminases，TGs)最重要的成員，在全身組織有廣泛分布。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)它參與了神經(jīng)發(fā)育、再生和行使功能。由tTG負(fù)責(zé)的蛋白翻譯后修飾可引起蛋白的交聯(lián)并參與多胺聚合成蛋白，這種反應(yīng)是鈣依賴性的，并可被三磷酸鳥

6、苷(guanosine triohosphte，GTP)抑制。tTG做為交聯(lián)劑依賴于其轉(zhuǎn)氨基活性，轉(zhuǎn)氨基作用是以肽鍵中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基作為酰基的供體，以多肽鏈中賴氨酰殘基ε-氨基作為酰基的受體，形成蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的ε-γ(-谷氨酰)賴氨酸異肽鍵，使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)并通過生物力學(xué)抗性阻止蛋白水解。tTG催化的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)引起的蛋白之間的交聯(lián)、形成不溶性復(fù)合物的特性被認(rèn)為是形成神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病(Alzheim

7、er's disease，AD)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)、多系統(tǒng)萎縮(multiple system atrophy，MSA)、亨廷頓病(Huntington's disease，HD)等的病因之一。
　　 在PD病人腦內(nèi)及共轉(zhuǎn)染α-synuclein和tTG的細(xì)胞模型中都發(fā)現(xiàn)了發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的α-synuclein和tTG，但是也有研究認(rèn)為生理狀態(tài)下α-synuclein與tTG之間并不能發(fā)生交

8、聯(lián)反應(yīng)。因此，何種形式的α-synuclein在細(xì)胞生理狀態(tài)下是tTG的適宜作用底物，以及二者相互作用的部位值得進(jìn)一步研究。
　　 基于上述的理論及研究成果，本課題通過制作穩(wěn)定表達(dá)野生型α-synuclein以及129位點(diǎn)由絲氨酸(serine,S)突變?yōu)楸彼?alanine，A)的突變型α-synuclein的SH-SY5Y細(xì)胞為研究模型，研究絲氨酸磷酸化的α-synuclein是否是tTG的合適作用底物，以及α-synuc

9、lein129位點(diǎn)絲氨酸磷酸化在二者反應(yīng)之中所處的地位，并探討二者之間發(fā)生的聚集反應(yīng)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響和所涉及到的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。我們還延續(xù)了前期利福平抑制PD細(xì)胞模型中α-synuclein聚集的試驗(yàn)研究，觀察驗(yàn)證利福平對(duì)PD大鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 本課題內(nèi)容分為五個(gè)部分：
　　 1.真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/α-synuclein及pcDNA3.1(+)/S129Aα-synuclein的鑒定；