磷酸化修飾ataxin-3與自吞噬的關(guān)系研究.pdf

1、脊髓小腦型共濟(jì)失調(diào)Ⅲ型/馬查多-約瑟夫病(SCA3/MJD)，是一種以神經(jīng)細(xì)胞變性、細(xì)胞核內(nèi)蛋白聚集體形成為病理特征的常染色體顯性遺傳病。其致病基因編碼區(qū)含一段異常擴(kuò)展的CAG三核苷酸重復(fù)序，基因編碼產(chǎn)物ataxin-3相應(yīng)含一段異常擴(kuò)展的多聚谷氨酰胺(polyglutamine，polyQ)肽鏈。目前包括SCA3/MJD在內(nèi)的所有polyQ疾病的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但擴(kuò)展突變的polyQ蛋白尤其是含polyQ鏈的短降解片段獲得毒性是

2、導(dǎo)致polyQ疾病發(fā)生的最基本原因這點(diǎn)已經(jīng)取得了大家的共識(shí)。研究表明自吞噬參與了降解ataxin-3等polyQ蛋白，藥物誘導(dǎo)自吞噬能明顯緩解擴(kuò)展突變型polyQ蛋白的細(xì)胞毒性。近年研究證實(shí)ataxin-3存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，磷酸化修飾ataxin-3參與調(diào)控其降解速度、細(xì)胞內(nèi)定位以及形成蛋白聚合體趨勢(shì)等，但關(guān)于ataxin-3的磷酸化修飾是否參與調(diào)節(jié)其被自吞噬降解的效率以及調(diào)節(jié)其毒性片段的產(chǎn)生還沒(méi)有研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)將從這方面探討磷酸化

3、修飾與自吞噬的關(guān)系。
　　 我們擬構(gòu)建ataxin-3的磷酸化位點(diǎn)缺失突變體(絲氨酸→丙氨酸/S→A)以及擬磷酸化突變體(絲氨酸→天冬氨酸/S→D)的真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，以探討磷酸化修飾對(duì)ataxin-3在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)自吞噬降解的影響。
　　 目的：探討磷酸化修飾ataxin-3對(duì)其通過(guò)自吞噬降解的影響。
　　 方法：
　　 1、構(gòu)建ataxin-3

4、的磷酸化位點(diǎn)缺失和擬磷酸化突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　 2、用自吞噬抑制劑3-MA處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞，運(yùn)用Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞ataxin-3的表達(dá)。
　　 3、用自吞噬激活劑Rapamycin處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞，運(yùn)用Westernblotting檢測(cè)各組細(xì)胞ataxin-3的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、經(jīng)3-MA抑制自吞噬處理細(xì)胞后，無(wú)論野生型還是polyQ擴(kuò)展突變型ataxin-3表達(dá)

5、均增加；經(jīng)Rapamycin誘導(dǎo)自吞噬處理細(xì)胞后，野生型和擴(kuò)展突變型ataxin-3表達(dá)均明顯減少。
　　 2、經(jīng)3-MA抑制自吞噬處理的各組細(xì)胞均明顯產(chǎn)生一條短的ataxin-3降解片段。ataxin-3磷酸化修飾對(duì)短片段產(chǎn)生無(wú)明顯影響。
　　 3、S260D突變后，可以促進(jìn)ataxin-3蛋白的降解，與Rapamycin有協(xié)同作用；而S260A突變后，對(duì)ataxin-3蛋白的降解無(wú)明顯影響。
　　 結(jié)論：