核蛋白SET絲氨酸9位點(diǎn)模擬磷酸化對(duì)PP2A的抑制作用.pdf

1、背景：阿爾茨海默病（Alzheimers Disease，AD）是最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病之一，神經(jīng)原纖維纏結(jié)和老年斑是其主要的病理學(xué)特征性改變。核蛋白SET/I2PP2A是絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶PP2A的內(nèi)源性抑制劑，主要分布在細(xì)胞核中，在細(xì)胞質(zhì)中分布很少；胞漿PP2A活性下調(diào)是阿爾茨海默?。ˋD）發(fā)病最為關(guān)鍵的原因也被認(rèn)可，但SET自核轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿的具體過(guò)程及其對(duì)PP2A活性影響的具體機(jī)制尚不清楚。
　　 方法：通過(guò)基因定點(diǎn)突變S

2、ET Ser-9為丙氨酸（相關(guān)位點(diǎn)不能被磷酸化）模擬SET的非磷酸化狀態(tài)（npSET），將Ser-9突變?yōu)楣劝彼幔ɡ闷銹O4基團(tuán)的負(fù)電荷效應(yīng)而更易磷酸化）模擬SET的磷酸化狀態(tài)（pSET），構(gòu)建npSET和pSET兩個(gè)質(zhì)粒。在細(xì)胞水平用Lipofectamine2000在HEK293/tau細(xì)胞轉(zhuǎn)染分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1，wtSET，npSET和pSET四個(gè)質(zhì)粒.在轉(zhuǎn)染后24 h，48 h和72 h后，使用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力；使

3、用絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶試劑盒測(cè)定PP2A活性；分別用westernblotting（WB）和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)來(lái)檢測(cè)tau蛋白過(guò)度磷酸化的程度和分布情況；WB檢測(cè)一些相關(guān)細(xì)胞凋亡因子的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 （1）HEK293/tau細(xì)胞在轉(zhuǎn)染磷酸化SET 24 h后細(xì)胞活力明顯降低，相比轉(zhuǎn)染野生型SET在48 h后才出現(xiàn)細(xì)胞活力降低，非磷酸化的SET在轉(zhuǎn)染24 h，48 h和72 h都不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力降低；

4、>　　 （2）磷酸化SET相比野生型SET對(duì)PP2A活性有更明顯抑制作用，抑制強(qiáng)度大約是野生型SET的1.25倍，p值為0.006，非磷酸化SET相比pcDNA3.1對(duì)PP2A沒(méi)有任何抑制作用；
　　 （3）在轉(zhuǎn)染48h后，磷酸化SET對(duì)tau蛋白一些位點(diǎn)磷酸化作用非常明顯，包括：Ser199，Thr205，Ser214，Ser262，Ser396和Ser404，而非磷酸化SET卻不能促使tau蛋白上述位點(diǎn)的磷酸化；
　

5、　 （4）在轉(zhuǎn)染48 h后，磷酸化SET能上調(diào)bax/bcl-2比率，增強(qiáng)p53活性卻沒(méi)有導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　 （5）過(guò)表達(dá)野生型，非磷酸化和磷酸化SET顯著上調(diào)GSK-3?活性。
　　 （6）非磷酸化和磷酸化SET可以修飾PP2Ac Tyr307位點(diǎn)，使其磷酸化增強(qiáng)。
　　 （7）野生型SET和磷酸化SET可以修飾PP2A Leu309位點(diǎn)，使其去甲基化。
　　 （8）過(guò)表達(dá)磷酸化SET可以上調(diào)