APJ受體羧基末端磷酸化位點對G蛋白非依賴信號途徑的影響.pdf

1、研究背景及目的：
　　G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)是目前已知最大的細胞膜表面受體超家族，可將胞外的多種信號分子（如氣味、光、多肽、脂質(zhì)、激素等）傳至細胞內(nèi)部，從而調(diào)節(jié)和維持生物體的穩(wěn)態(tài)。GPCRs在人體內(nèi)廣泛表達，其信號傳導通路的失調(diào)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。目前，臨床上超過50％的藥物以GPCRs作為靶點。
　　本研究旨在闡明APJ羧基末端確切的磷酸化位點，觀察這

2、些位點對APJ受體的脫敏、內(nèi)吞和G蛋白非依賴的信號途徑的影響，進而為心血管系統(tǒng)藥物的篩選提供新的實驗依據(jù)和思路。
　　研究方法：
　　1.細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:
　　采用人胚胎腎細胞(HEK293)作為研究對象;脂質(zhì)體Lipofectamine2000為轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細胞。
　　2.質(zhì)譜檢測:
　　提取APJ受體蛋白，通過烷基化和富集處理后，LC-MS/MS質(zhì)譜分析APJ受體的磷酸化位點。
　　3.點突變及真

3、核表達載體的構(gòu)建:
　　重疊延伸PCR技術(shù)將APJ受體羧基末端335、345和348位點的絲氨酸(S)用丙氨酸(A)替代;限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切擴增產(chǎn)物和載體、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定、基因測序鑒定，構(gòu)建人APJ受體羧基末端磷酸化位點突變的真核表達載體。
　　4.酶聯(lián)免疫吸附實驗:
　　檢測細胞膜表面野生型APJ受體及APJ突變體的表達量;檢測細胞內(nèi)cAMP的含量。
　　5.放射性配體結(jié)合實

4、驗:
　　檢測野生型APJ受體或構(gòu)建的APJ突變體與配體的結(jié)合力。
　　6.激光共聚焦共聚焦實驗:
　　檢測野生型APJ受體及APJ突變體在細胞膜表面的定位及受體內(nèi)吞過程。
　　7.劑量反應和實時動態(tài)BRET實驗:@檢測野生型APJ受體或APJ突變體與GRK2/5或β-arrestin1/2相互作用的劑量反應和實時動態(tài)關系。
　　8.免疫共沉淀實驗:
　　檢測APJ受體與β-arrestin1或β-a

5、rrestin2之間的相互作用。
　　9.細胞內(nèi)鈣離子檢測實驗:
　　Fluo-4 NW檢測激動劑刺激對細胞內(nèi)鈣離子含量變化的影響。
　　10.Western blot實驗:
　　檢測激動劑對細胞內(nèi)ERK1/2磷酸化水平的影響。
　　11.統(tǒng)計學分析:
　　所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤（Mean±SEM）表示，采用GraphPad Prism5.0軟件進行統(tǒng)計學分析。
　　研究結(jié)果：
　　1.

6、APJ受體羧基末端磷酸化位點的鑒定
　　NetPhos2.0分析軟件預測APJ受體蛋白序列的磷酸化位點分別為ser335、ser345和ser348。隨后，質(zhì)譜分析法明確apelin-13刺激后，APJ受體確定的磷酸化位點為ser345和ser348。
　　2.APJ受體突變體真核表達載體的構(gòu)建
　　將APJ受體羧基末端335、345和348位點的絲氨酸(S)用丙氨酸(A)替代。構(gòu)建人APJ受體羧基末端磷酸化位點突變的

7、真核表達載體，測序證實突變體重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。
　　3.野生型APJ受體和APJ受體突變體的亞細胞定位分析
　　ELISA和BRET實驗發(fā)現(xiàn)APJ-S335A、APJ-S345A和APJ-S348A突變體與野生型APJ受體表達量相當，點突變對APJ受體的細胞膜表面表達沒有產(chǎn)生明顯的影響，差異無統(tǒng)計學意義。
　　4.野生型APJ受體或APJ受體突變體對配體結(jié)合力的影響
　　放射配體結(jié)合分析技術(shù)證實APJ受體羧基末端

8、磷酸化位點的突變并不影響配體的結(jié)合。至少，ser335、345和348并不是apelin-13結(jié)合的關鍵位點。
　　5.野生型APJ受體和APJ受體突變體的功能鑒定
　　穩(wěn)定表達野生型APJ受體或APJ受體突變體的HEK293細胞中，APJ-S335A、APJ-S345A和APJ-S348A三種突變體都以劑量依賴性的方式抑制了弗司可林(forskolin，F(xiàn)SK)誘導的cAMP生成。同樣，apelin-13均能誘導三種突變體

9、胞內(nèi)Ca2+釋放的顯著性增加，與野生型APJ受體基本一致。
　　6.APJ受體絲氨酸348位點對apelin-13誘導的受體內(nèi)吞的影響
　　在穩(wěn)定表達APJ受體的HEK293細胞，apelin-13(100nM)刺激5min后受體內(nèi)吞開始。激動劑作用30min，大約有50％的受體離開細胞膜表面發(fā)生內(nèi)吞。激動劑持續(xù)60min后，大約70％的受體回到細胞膜表面。與野生型APJ受體比較，apelin-13誘導的APJ-S335A和

10、APJ-S345A突變體內(nèi)吞沒有發(fā)生明顯改變。然而，ser348位點的突變使受體的內(nèi)吞作用受到明顯抑制。
　　激光共聚焦實驗發(fā)現(xiàn)，野生型APJ受體和APJ-S335A、APJ-S345A、APJ-S348A突變體清晰的表達在細胞膜的表面。激動劑的作用下，APJ-S335A和APJ-S345A突變體的內(nèi)吞過程與野生型受體相似。然而，在apelin-13的刺激下，APJ-S348A突變體失去了向胞漿移位的能力，不能與胞漿中的β-arr

11、estin1或β-arrestin2蛋白發(fā)生共定位。
　　7.APJ受體絲氨酸348位點對GRK2/5或β-arrestin1/2募集的影響
　　BRET2檢測apelin-13對APJ與GRK2/5相互作用的劑量反應關系。研究表明，GRK2被招募到激動劑活化的受體。EC50值分別為:6.58±0.58nM(WTAPJ)，6.20±1.56nM(APJ-S335A)，5.69±1.42nM(APJ-S345A)。同樣，APJ

12、與GRK5相互作用的EC50值分別為:9.45±2.58nM(WTAPJ)，8.20±1.85nM(APJ-S335A)，7.34±1.17nM(APJ-S345A)。然而，在不同濃度激動劑的作用下，APJ-S348A突變體均失去了與GRK2或GRK5相互作用的能力。
　　BRET1檢測apelin-13對APJ與β-arrestin1/2相互作用的劑量反應關系。研究表明，β-arrestin1與野生型受體或突變體相互作用的EC5

13、0值分別為:5.69±0.71nM(WTAPJ),5.06±1.05nM(APJ-S335A),5.55±0.94nM(APJ-S345A)。β-arrestin2與野生型受體或突變體相互作用的EC50值分別為:8.29±1.25nM(WTAPJ),7.25±0.73nM(APJ-S335A),7.55±1.03nM(APJ-S345A)。 APJ-S348A突變體均失去了與β-arrestin1或β-arrestin2相互作用的能力。

14、
　　免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)只有在FLAG-β-arrestin1（或FLAG-β-arrestin2）和HA-APJ共轉(zhuǎn)染的細胞樣品中，顯示出HA抗體沉淀下來的抗FLAG抗體反應的條帶。而在FLAG-β-arrestin1（或FLAG-β-arrestin2）和HA-APJ-S348A共轉(zhuǎn)染的細胞樣品及對照組中，均未發(fā)現(xiàn)HA抗體沉淀下來的抗FLAG抗體反應免疫條帶。
　　濃度依賴的ERK1/2磷酸化實驗顯示:不同濃度的apel

15、in-13作用15min，HEK293-APJ絀胞表現(xiàn)出濃度依賴的ERK1/2磷酸化。然而，激動劑作用HEK293-APJ-S348A細胞相同的時間，各種濃度的apelin-13均未誘導出ERK1/2的磷酸化。繼而縮短激動劑的作用時間，觀察apelin-13刺激5min，HEK293-APJ細胞和HEK293-APJ-S348A細胞引起ERK1/2磷酸化的劑量依賴關系，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)兩組絀胞表現(xiàn)出統(tǒng)計學的差異。
　　PTX預處理阻斷

16、Gαi/o蛋白后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HEK293-APJ細胞和HEK293-APJ-S348A細胞，apelin-13誘導的ERK1/2磷酸化均表現(xiàn)出明顯的降低。
　　轉(zhuǎn)染特異的shRNA抑制胞內(nèi)的β-arrestin表達，觀察apelin-13誘導的ERK1/2磷酸化過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染shRNA對照組的HEK293-APJ細胞，apelin-13誘導的ERK1/2磷酸化與未轉(zhuǎn)染組完全一致。然而，HEK293-APJ細胞分別轉(zhuǎn)染β-arr

17、estin1 shRNA或β-arrestin2 shRNA，apelin-13作用15min后的ERK1/2磷酸化水平明顯降低。HEK293-APJ348細胞中轉(zhuǎn)染β-arrestin shRNA后，apelin-13誘導的晚期ERK1/2磷酸化同樣處于極低的水平，與野生型受體比較無顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　APJ受體的348位氨基酸是GRKs和β-arrestin結(jié)合的關鍵位點，其突變影響了受體的脫敏、內(nèi)吞、復敏過程