PKCδ介導(dǎo)BAG3蛋白Ser187位點磷酸化的功能解析.pdf

1、目的：
　　PKCδ(Protein kinase Cδ，PKCδ)在細胞的生長、分化、凋亡、腫瘤進展中發(fā)揮非常重要的作用，但目前關(guān)于PKCδ在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的具體作用還不十分清楚，關(guān)于PKCδ的激酶生理性作用底物方面的研究也甚少。本研究小組前期工作首次發(fā)現(xiàn)BAG3是PKCδ的磷酸化底物。
　　BAG(Bcl-2 associated athanogene，BAG)家族是20世紀90年代初新發(fā)現(xiàn)的細胞凋亡調(diào)控蛋白家族，其成員可以

2、通過“BAG”功能區(qū)與熱休克蛋白(Heat-shockprotein，Hsp)家族成員結(jié)合。BAG3是BAG家族成員之一，與熱休克蛋白Hsp70/Hsc70具有高度親和力，通過作用于Hsp70/Hsc70產(chǎn)生非常廣泛的細胞生物學(xué)效應(yīng)，如抑制細胞凋亡、促進腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移等。BAG3雖然本身的抗凋亡作用有限，但它能與抗凋亡蛋白Bcl-2結(jié)合并發(fā)揮協(xié)同作用，拮抗bax和Fas/FasL介導(dǎo)的細胞凋亡作用。BAG3還可以直接與粘著斑激酶(F

3、ocal adhesion kinase，F(xiàn)AK)相互作用，調(diào)控腫瘤細胞粘著和遷移;并且BAG3的表達水平與多種腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移及侵襲關(guān)系密切。另外，BAG3還能與磷脂酶C(Phospholipase Cγ，PLCγ)特異結(jié)合，在表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）受體酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物被激活后，BAG3與PLCγ解離，激活Hsp70/Hsc70，參與EGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控。BAG3在大部分正常人體組

4、織中表達很弱或不表達，但在白血病細胞和許多實體腫瘤中表達明顯增加，BAG3的高水平表達維持腫瘤細胞的存活，抑制BAG3的表達可以明顯增加腫瘤細胞對TRAIL、蛋白酶體抑制劑等化療藥物的反應(yīng)性。這些研究表明，BAG3通過與Bcl-2、Hsp70、PLCγ、 FAK等多種蛋白相互作用，在多個水平調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡、運動、遷移及侵襲等行為，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及對化療藥物敏感性關(guān)系密切。
　　翻譯后修飾使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，功能更

5、為完善，調(diào)節(jié)更為精細，作用更為專一，是基本生命活動完成的必須條件。其中，磷酸化是最普遍的翻譯后修飾方式之一。有研究表明BAG3蛋白在細胞內(nèi)保持基礎(chǔ)水平的磷酸化狀態(tài)，在基礎(chǔ)條件下BAG3與PLCγ、 Hsp70/Hsc70相互作用，形成三元復(fù)合物。表皮生長因子信號促進BAG3與PLCγ解離，同時激活Hsp70/Hsc70，增加PLCγ和BAG3蛋白磷酸化水平;而廣譜PKC抑制劑可以降低BAG3基礎(chǔ)水平磷酸化，并且可以抑制EGF誘導(dǎo)的BAG

6、3與PLCγ的解離。PLCγ是磷脂酶C家族的一個重要成員，在許多腫瘤組織和腫瘤細胞系中PLCγ的表達升高，并且與腫瘤的增殖、遷移、運動及侵襲等行為關(guān)系密切。表皮生長因子作為其上游信號分子，通過磷酸化PLCγ參與腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲等行為的調(diào)節(jié)。這些結(jié)果表明BAG3蛋白可被磷酸化修飾，并且BAG3的磷酸化修飾可能通過調(diào)控EGF介導(dǎo)的PLCγ活化，參與腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲等行為的調(diào)節(jié)。然而執(zhí)行BAG3磷酸化的具體激酶、磷酸化的具體作

7、用靶點及其功能尚不清楚。前期工作中我們鑒定出BAG3是PKCδ的磷酸化底物，提示PKCδ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能通過磷酸化BAG3，進而調(diào)節(jié)其生物學(xué)功能。
　　本研究擬論證PKCδ介導(dǎo)BAG3蛋白磷酸化對腫瘤細胞運動、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響及其潛在的分子機制。通過本項目的進一步深入解析，將加深我們對BAG3上游調(diào)控信號以及PKCδ生理性激酶作用底物的理解，加深我們對BAG3及PKCδ在腫瘤發(fā)生、進展以及耐藥等方面機制的理解，對于尋找

8、新的藥物作用靶點和腫瘤標(biāo)志物都具有非常積極的意義和重要參考價值。
　　方法：
　　1、培養(yǎng)CHO細胞，建立WT-PKCδ、DN-PKCδ、CA-PKCδ穩(wěn)定過表達CHO細胞系;培養(yǎng)甲狀腺癌FRO細胞，建立WT-BAG3、S187A-BAG3、S187D-BAG3穩(wěn)定過表達FRO細胞系。
　　2、應(yīng)用磷酸化蛋白宮集、二維差異凝膠電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)確定PKCδ的底物，并通過Western blot和免疫共沉淀確定PKCδ和

9、BAG3之間的相互作用。體外激酶實驗確定BAG3蛋白的磷酸化位點。
　　3、相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化并成像，對比各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系細胞形態(tài)的區(qū)別。鬼筆環(huán)肽對細胞骨架染色后，熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化并成像，應(yīng)用專業(yè)軟件測定細胞長軸、短軸直徑后計算其比值，對細胞形態(tài)的變化進行定量分析。
　　4、應(yīng)用Real-time PCR、Western blot、免疫熒光技術(shù)檢測各穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FRO細胞系中EMT標(biāo)記物E-cadherin、

10、N-cadherin、Vimentin、β-catenin的表達量及表達位置變化。
　　5、劃痕修復(fù)實驗、transwell轉(zhuǎn)移小室、三維Matrigel轉(zhuǎn)移小室實驗觀察各穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FRO細胞系中細胞遷移、侵襲能力的變化。
　　6、應(yīng)用PKCδ特定激活劑、抑制劑處理WT-BAG3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FRO細胞系，觀察腫瘤細胞侵襲的變化，以探討其可能的機制。
　　結(jié)果：
　　1、BAG3是PKCδ的磷酸化底物之一，兩者之間存在一

11、定的相互作用，PKCδ在Ser187位點磷酸化BAG3。
　　2、BAG3蛋白Ser187位點磷酸化影響細胞形態(tài)，模擬磷酸化S187D-BAG3穩(wěn)定過表達FRO細胞變得狹長，呈紡錘狀，細胞連接變得松散，形態(tài)更趨于間質(zhì)細胞;阻礙磷酸化S187A-BAG3穩(wěn)定過表達FRO細胞變得立方，細胞連接緊密，形態(tài)趨于上皮細胞。
　　3、BAG3蛋白Ser187位點磷酸化狀態(tài)影響FRO細胞EMT標(biāo)志物的表達量，S187D-BAG3穩(wěn)定過表達

12、FRO細胞間質(zhì)細胞標(biāo)志物N-cadherin和波形蛋白表達水平提高，上皮細胞標(biāo)記物E-cadherin表達水平下降。S187A-BAG3穩(wěn)定過表達FRO細胞間質(zhì)細胞標(biāo)記物N-cadherin和波形蛋白表達水平較低，而上皮細胞標(biāo)記物E-cadherin的表達水平較高。
　　4、BAG3蛋白Ser187位點磷酸化導(dǎo)致FRO細胞EMT標(biāo)志物的表達位置變化，免疫熒光結(jié)果顯示S187D-BAG3穩(wěn)定過表達FRO細胞中E-cadherin的表

13、達出現(xiàn)了向核周的內(nèi)化，在WT-BAG3和S187D-BAG3穩(wěn)定過表達FRO細胞中可見β-catenin的表達提高并且向細胞內(nèi)發(fā)生了重新分布，尤其在S187D-BAG3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FRO細胞β-catenin主要表達在核周。
　　5、BAG3蛋白Ser187位點磷酸化影響FRO細胞的遷移侵襲，坐標(biāo)定點劃痕修復(fù)實驗顯示W(wǎng)T-BAG3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FRO細胞運動能力提高，S187D-BAG3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FRO細胞遷移能力進一步提高，轉(zhuǎn)移小室實驗同樣