SLP76各結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點(diǎn)的功能性研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)室早期的工作是運(yùn)用T7噬菌體展示技術(shù)從人肺的cDNA文庫(kù)中篩選到與晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)胞內(nèi)段作用的蛋白12種，含有SH2結(jié)構(gòu)域的76 kDa的白細(xì)胞蛋白(SLP76)是其中一種。SLP76與RAGE的體內(nèi)、體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)均證實(shí)二者之間存在相互作用。同時(shí)我們證實(shí)這種相互作用存在刺激依賴(lài)性。
　　SLP76是血源性細(xì)胞所特有的一種接頭蛋白，其在T細(xì)胞受體相關(guān)信號(hào)通路及凝血功能方面起到重要作用，在細(xì)胞中SLP76可以和多種

2、蛋白相互作用，并參與多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。SLP76的結(jié)構(gòu)包括氨基末端的SAM結(jié)構(gòu)域、羧基末端的SH2結(jié)構(gòu)域和位于二者之間的富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域及多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。
　　晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物大分子在氧化環(huán)境里的一種還原糖共價(jià)加成物。特別在生物大分子循環(huán)代謝速率減慢（如衰老）和一些易造成氧化應(yīng)激的疾?。ㄈ缣悄虿?、動(dòng)脈粥樣硬化等）過(guò)程中生成增多。與其他受體介導(dǎo)AGEs清除不同的是，RAGE與AGEs結(jié)合后可

3、激活細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而發(fā)揮其病理生理功能。
　　研究表明SLP76或RAGE與不同的配體結(jié)合都可以導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化。因此我們可以提出如下假設(shè):當(dāng)RAGE與其配體相互作用后，RAGE胞內(nèi)段通過(guò)與由SLP76參與的接頭蛋白復(fù)合體相互作用，再由復(fù)合體中的Grb2將信號(hào)傳遞給Ras，Ras可以激活下游的絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶Raf，信號(hào)由高度保守的三級(jí)激酶模式向下游傳遞，進(jìn)而觸動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激并導(dǎo)致NF-κB

4、的活化，使得效應(yīng)細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)譜發(fā)生變化，產(chǎn)生相應(yīng)的生理學(xué)和病理學(xué)功能。
　　如果上述假設(shè)能夠得到證實(shí)，對(duì)闡明RAGE和SLP76相互作用在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的作用具有重要意義，并且能夠以RAGE和SLP76相互作用為切入點(diǎn)揭示RAGE相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制。為此我們構(gòu)建了一系列SLP76的突變體，對(duì)SLP76突變體在整個(gè)過(guò)程中介導(dǎo)的功能進(jìn)行了初步研究。實(shí)驗(yàn)分幾個(gè)階段進(jìn)行。第一階段，制備AGEs。第二階段，構(gòu)建十種SLP76突變體。

5、第三階段，SLP76突變體對(duì)MAPK磷酸化的影響。第四階段，SLP76突變體對(duì)自身酪氨酸磷酸化的影響。第五階段，SLP76突變體對(duì)RAGE-SLP76相互作用的影響。
　　綜上所述，我們成功制備了具有生物學(xué)活性的AGEs;成功構(gòu)建了十種SLP76突變體，且SLP76各突變體在HEK293細(xì)胞中均有穩(wěn)定表達(dá);免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)初步確定了SLP76與RAGE相互作用的候選結(jié)構(gòu)域及位點(diǎn)，為SAM結(jié)構(gòu)域，第145為酪氨酸，第173位酪氨酸，第