年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體蛋白磷酸化位點鑒定.pdf

1、白內(nèi)障是全球首位致盲眼病，而年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age related cataract，ARC)也是老年人視力下降的主要原因。目前手術(shù)仍是治療白內(nèi)障唯一有效的方法，由于我國人口數(shù)量龐大，經(jīng)濟欠發(fā)達，高昂的手術(shù)費用會給社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔。因此，預防或者推遲ARC發(fā)病，無疑具有重要意義。
　　 磷酸化是一種常見蛋白質(zhì)翻譯后修飾，磷酸化與去磷酸化這一可逆的過程調(diào)節(jié)著信號傳導、基因表達等多種細胞生物學進程，而蛋白質(zhì)磷酸化修飾的異常會

2、引發(fā)一系列疾病。晶狀體蛋白是人晶狀體內(nèi)含量最高的結(jié)構(gòu)與功能蛋白，研究者推測晶狀體蛋白的磷酸化與去磷酸化的過程失調(diào)可能是ARC發(fā)病的早期改變或者說是晶狀體蛋白變性前的病變。
　　 由于晶狀體蛋白磷酸化過程是可逆的，因此在晶狀體蛋白尚未發(fā)生變性的早期，也即白內(nèi)障形成之前是干預ARC發(fā)病的有效時機。鑒定晶狀體蛋白的磷酸化位點，將是進一步探索位點功能的第一步。
　　 本實驗首次利用原位酶解聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜鑒定人透明晶

3、狀體與ARC晶狀體組織切片中的磷酸化位點。研究者在人透明晶狀體中鑒定到了4種晶狀體蛋白中的8個磷酸化位點；在ARC晶狀體中鑒定到了6種晶狀體蛋白中的11個磷酸化位點，其中9個磷酸化位點先前未有報道。
　　 本實驗為進一步的磷酸化位點質(zhì)譜成像定位和磷酸化位點的功能學研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 第一部分
　　 晶狀體冰凍切片及質(zhì)譜鑒定條件的優(yōu)化
　　 目的：探求人晶狀體組織冰凍切片的最佳條件并優(yōu)化基質(zhì)輔助激光解析

4、電離質(zhì)譜對晶狀體組織切片鑒定的實驗參數(shù)。
　　 方法：(1)將-80℃凍存的人透明晶狀體與ARC晶狀體分別在-10℃至-25℃溫度下沿赤道部軸向切片，切片厚度10μm至20μm，用解剖鏡觀察所得切片，確定最適宜的溫度與切片厚度。
　　 (2)使用標準蛋白細胞色素C與馬心肌紅蛋白作為標準蛋白，從基質(zhì)種類、基質(zhì)噴涂層數(shù)、噴涂速度等各方面優(yōu)化并探尋最佳的基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜鑒定晶狀體組織切片中磷酸化位點的實驗參數(shù)。

5、　　 結(jié)果：經(jīng)過解剖鏡觀察，最適宜的切片溫度為-18℃，切片厚度為14μm。此條件下切片完整性好，易于轉(zhuǎn)移和進一步的質(zhì)譜鑒定。基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜鑒定人晶狀體組織切片的最佳實驗條件為：以加入0.1％三氟乙酸、0.6-0.8mg/ml檸檬酸氨的濃度為2.5mg/mL的α-氰基-4-羥基-肉桂酸(50％乙腈：50％水)為基質(zhì)，直接噴涂在組織切片表面；加熱溫度120℃，基質(zhì)流速0.100ml/min，噴頭移動速度200mm/min，晾干

6、后進行質(zhì)譜檢測。所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用DataExPlorer4.5進行后期處理。
　　 結(jié)論：確立了人晶狀體組織冰凍切片的最佳條件，并優(yōu)化了基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜對人晶狀體組織切片鑒定的實驗條件與實驗參數(shù)，為進一步的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分
　　 原位酶解結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜鑒定晶狀體蛋白磷酸化位點
　　 目的：在優(yōu)化了的實驗條件下，利用原位酶解聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜鑒定年齡相關(guān)性白內(nèi)

7、障晶狀體及人透明晶狀體中晶狀體蛋白的磷酸化位點并比較其差異。
　　 方法：(1)將-80℃凍存的人透明晶狀體與年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體在-18℃溫度下沿赤道部軸向切片，切片厚度14μm，隨后將組織切片轉(zhuǎn)移至蓋玻片上。
　　 (2)用肌紅蛋白、牛血清白蛋和α-酪蛋白作為標準蛋白對胰蛋白酶-石墨烯固定化酶反應器的酶解效率進行考察。
　　 (3)利用胰蛋白酶-石墨烯固定化酶反應器聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜鑒定人透明晶狀

8、體與年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體組織切片中的磷酸化位點，所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用DataExPlorer4.5進行后期處理。
　　 結(jié)果：研究者在人透明晶狀體中鑒定到了4種晶狀體蛋白中的8個磷酸化位點；在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體中鑒定到了6種晶狀體蛋白中的11個磷酸化位點，其中9個磷酸化位點先前未有報道。
　　 結(jié)論：首次利用原位酶解聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體中鑒定到了6種晶狀體蛋白中的11個磷酸化位點，為進一