MicroRNa-34a在年齡相關(guān)性白內(nèi)障的表達(dá)改變及其對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制研究.pdf

1、引言：年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)是全球致盲眼病的主要原因，手術(shù)仍是目前唯一的治療途徑，隨著當(dāng)今社會(huì)老齡化的進(jìn)展，白內(nèi)障手術(shù)需求量將逐年增加，給國(guó)民帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此深入研究ARC的根本發(fā)病機(jī)制，以期找到早期有效的干預(yù)措施，具有重要意義。機(jī)體衰老是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，也是生命科學(xué)領(lǐng)域一直以來(lái)想要攻克的難題，其中包括晶狀體的老化，即白內(nèi)障形成，也是機(jī)體內(nèi)外各種環(huán)境、代謝因素參與致病的結(jié)果。已有研究證明表觀遺傳調(diào)控與環(huán)境危險(xiǎn)因素和其他調(diào)節(jié)因

2、素存在密切聯(lián)系，因此推測(cè)其在ARC復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。表觀遺傳學(xué)調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾及微小RNA(microRNA)，是不涉及DNA序列改變的基因組修飾作用。其中microRNA是一組單鏈、內(nèi)源性的非編碼小RNA，通常與靶基因序列3'UTR特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、分化、增殖、凋亡、應(yīng)激及衰老等生物學(xué)進(jìn)程。往年microRNA一直是腫瘤、血液中的研究熱點(diǎn)之一，

3、而其在眼部疾病中的作用卻較少引起學(xué)者關(guān)注，近年來(lái)microRNA在眼科疾病中的研究也已初步展開。首次報(bào)道顯示microRNA的表達(dá)譜在人透明晶狀體上皮與白內(nèi)障晶狀體上皮中有顯著差異，這提示microRNA的異常表達(dá)在晶狀體發(fā)育、白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用?；谀壳暗难芯楷F(xiàn)狀，本文將著重研究microRNA參與ARC發(fā)病機(jī)制的具體分子機(jī)制，在體內(nèi)篩選、驗(yàn)證microRNA在ARC中表達(dá)的改變，在體外探究microRNA誘導(dǎo)人品狀體

4、上皮細(xì)胞功能學(xué)改變的具體分子機(jī)制，并試圖探索在ARC中異常表達(dá)的microRNA啟動(dòng)子DNA甲基化是否參與調(diào)控，是否共同相互作用參與ARC的發(fā)病機(jī)制。
　　第一部分 MicroRNA-34a在ARC的表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化水平
　　目的：探討microRNA-34a(miR-34a)在年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)中的表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化程度改變。
　　方法：收集ARC晶狀體前囊膜30例，透明晶狀體前囊膜18例，采用RT-P

5、CR檢測(cè)miR-34a和miR-933的表達(dá)水平，并評(píng)價(jià)其表達(dá)在兩組間的差異;選擇在ARC組較對(duì)照組表達(dá)差異最顯著的miR-34a為研究對(duì)象，在12例ARC前囊膜及8例透明對(duì)照前囊膜組織進(jìn)行焦磷酸鹽測(cè)序，檢測(cè)miR-34a啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化程度。
　　結(jié)果：miR-34a在白內(nèi)障組表達(dá)高于透明晶狀體組，miR-933的表達(dá)水平未見明顯差異;其啟動(dòng)子甲基化程度在兩組間無(wú)顯著差異。
　　結(jié)論：miR-34a在ARC前囊膜表達(dá)升

6、高，可能參與了ARC發(fā)病。
　　第二部分MicroRNA-34a調(diào)控人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)功能研究
　　目的:研究miR-34a對(duì)HLECs凋亡的影響。
　　方法:體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞系SRA01/04，將miR-34a雙鏈模擬物(miR-34a mimics)和陰性對(duì)照模擬物(negative mimics)分別轉(zhuǎn)染至人晶狀體上皮細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染后24至72小時(shí)，流式細(xì)胞儀分析miR-34a轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡的改變，并

7、檢測(cè)caspase3/7活性;Western Blot尋找上游激活靶蛋白;熒光顯微鏡觀察JC-1染色后線粒體內(nèi)膜電位改變，WB檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)及線粒體細(xì)胞色素C(Cyto C)含量評(píng)價(jià)線粒體外膜功能;提取細(xì)胞總RNA，分析線粒體呼吸鏈上相關(guān)功能基因的表達(dá);DCFH-DA探針法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧積聚程度。
　　結(jié)果:miR-34a mimics轉(zhuǎn)染48小時(shí)后SRA01/04發(fā)生早期及晚期凋亡的比例較對(duì)照組增加，活化的caspase3/7表達(dá)

8、升高。JC-1染色提示miR-34a過(guò)表達(dá)導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞線粒體內(nèi)膜電位下降，WB顯示Cyto C的含量在胞漿中顯著大于線粒體內(nèi)，說(shuō)明線粒體外膜通透性增加、功能受損;同時(shí)線粒體呼吸鏈上相關(guān)基因NDUFS8、COX5b和ATP5a1表達(dá)明顯下降，提示線粒體呼吸鏈電子傳遞功能受損;DCFH探針熒光在miR-34a組顯著高于對(duì)照組，提示miR-34a過(guò)表達(dá)導(dǎo)致自由基產(chǎn)生，使胞內(nèi)活性氧基團(tuán)（ROS）蓄積誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　結(jié)論:晶狀

9、體上皮細(xì)胞中miR-34a過(guò)表達(dá)可通過(guò)損傷線粒體功能而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　第三部分 MicroRNA-34a調(diào)控人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究
　　目的:研究miR-34a在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制。
　　方法:聯(lián)合利用生物信息學(xué)分析網(wǎng)站(Pictar、TargetScan、MiRanda)篩選miR-34a的候選靶基因，絕對(duì)定量PCR驗(yàn)證晶狀體上皮細(xì)胞中候選靶基因的表達(dá)，在轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物與

10、陰性對(duì)照模擬物的SRA01/04中利用相對(duì)定量PCR和WB檢測(cè)靶基因表達(dá);構(gòu)建miR-34a與靶基因3'UTR互補(bǔ)結(jié)合的質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染至HEK293-T細(xì)胞，并用雙熒光素酶報(bào)告基因分析在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行靶基因驗(yàn)證。確定靶基因后，轉(zhuǎn)染靶基因的si-RNA以實(shí)現(xiàn)靶基因敲減，再次利用流式細(xì)胞、caspase3/7活性與caspase9的WB評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡及線粒體功能的改變。
　　結(jié)果:篩選出靶基因Notch1、Notch2、Jag1、Jag2均

11、位于Notch通路并在晶狀體上皮中表達(dá)，Notch1及Notch2是此通路中關(guān)鍵的受體蛋白基因，PCR及WB顯示在轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物的晶狀體上皮細(xì)胞中Notch1及Notch2的表達(dá)較對(duì)照組受到抑制;雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示Notch1和Notch2的3'UTR螢火蟲活性在miR-34a過(guò)表達(dá)組顯著抑制，而突變型質(zhì)粒則對(duì)miR-34a過(guò)表達(dá)及陰性對(duì)照組間螢火蟲熒光活性無(wú)明顯改變，由此確定miR-34可直接與Notch1、Notc

12、h2的3'UTR結(jié)合抑制其表達(dá)。進(jìn)而在晶狀體上皮細(xì)胞中將Notch1及Notch2基因敲減，進(jìn)行流式凋亡功能檢測(cè)及caspase3/7活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Notch1敲減組細(xì)胞凋亡及caspase3/7活性增加不顯著，而Notch2敲減組細(xì)胞早期及晚期凋亡顯著增加，caspase3/7活性也較對(duì)照組顯著升高。并且在Notch2敲減組的晶狀體上皮細(xì)胞中線粒體凋亡標(biāo)志蛋白caspase9的表達(dá)顯著升高。
　　結(jié)論:miR-34a通過(guò)抑制靶基