人晶狀體細胞膜流動性的年齡相關性改變及可溶性晶狀體蛋白的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、人的晶狀體是一個特殊的器官,其赤道部的晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells,LECs)不斷分化形成新的晶狀體纖維,并向核區(qū)移行,在此過程中纖維細胞的細胞核和細胞器不斷退化消失,僅留下透明的細胞質(zhì),從而形成了幾乎不存在蛋白質(zhì)更新的核區(qū)。這一核區(qū)擔負著人眼調(diào)節(jié)的主要形變?nèi)蝿?同時它又是翻譯后修飾的主要區(qū)域,雙重的負荷使其容易受到各種年齡效應的影響。
　　隨著年齡的增長,晶狀體組織的硬度明顯增加,尤其是核區(qū),從而加

2、速了老視和年齡相關性白內(nèi)障的發(fā)生。由于晶狀體核區(qū)的含水量并未發(fā)生明顯的改變,這種硬度的增加與核區(qū)內(nèi)纖維的累積關系不大。研究表明,到了中年,人品狀體中50％原本可溶性的蛋白質(zhì)變得不溶,從而使晶狀體的硬度增加:而對紅細胞和膽管細胞的研究表明,隨著年齡的增長其細胞膜的流動性會不斷下降。
　　那么人品狀體細胞膜會發(fā)生什么樣的年齡相關性改變呢,變的更致密還是流動性增加?它的改變是不是也是晶狀體硬度增加的原因之一呢?本研究通過觀察分析人晶狀體

3、細胞膜流動性的年齡相關性改變,探索促使其變化的可能原因,來明確這些疑問。
　　第一部分人晶狀體細胞膜流動性年齡相關性改變的研究
　　目的：觀察入晶狀體細胞膜流動性的年齡相關性改變。
　　方法：23對人晶狀體,22-83歲。每對中一個品狀體制作冠狀位切片,取中央部位的切片進行6-酰基-2-二甲酰氨基萘(6-acyl-2-dimethylaminonapthalene,Laurdan)染色,并用雙光子共聚焦顯微鏡沿切片最長

4、軸連續(xù)采集圖像,用軟件計算轉(zhuǎn)換得到GP(Generalized Polarization)圖,把來自同一切片的GP圖像用ImageJ-MosaicJ軟件組合后,分別測量中心點兩側(cè)距離為0.75,2,3,3.5,4,4.5mm處的GP值。每對中另一個晶狀體用模具解剖成外部、屏障部、內(nèi)部和核心部,進行脂質(zhì)提取,并用質(zhì)譜分析每個部分的膽固醇含量。
　　結(jié)果：20-40歲時,晶狀體從外到內(nèi)的細胞膜流動性幾乎恒定;隨著年齡的增加,人晶狀體中

5、央的細胞膜流動性逐漸增加,而距中心3.5mm以外的細胞膜流動性改變不明顯。膽固醇的含量沒有明顯的年齡性或區(qū)域性改變。
　　結(jié)論：人晶狀體核區(qū)的細胞膜流動性隨年齡增加而增加,這與膽固醇含量的變化并不相關。
　　第二部分人晶狀體細胞膜流動性與可溶性晶狀體蛋白含量改變的相關性研究
　　目的：分析人晶狀體細胞膜流動性與可溶性晶狀體蛋白含量改變的相關性。
　　方法：3對晶狀體,年齡分別為31,40,63歲,每對中的一個晶狀

6、體直接制作冠狀位切片,另一個晶狀體則在50℃:加熱20小時后制作冠狀位切片,切片的染色觀察如第一部分。所有切片后剩余的組織用模具解剖獲得核心部位組織,用凝膠過濾HPLC分析可溶性晶狀體蛋白含量。另取一對38歲的晶狀體,一個晶狀體用模具獲得直徑6mm以內(nèi)的核組織,均分成5塊,另一個晶狀體進行連續(xù)切片,以1塊組織和3個切片為一組,分別在50℃加熱0,4,8,16和24 h,分析可溶性晶狀體蛋白含量改變,并測量各組切片的GP值改變。
　

7、　結(jié)果：50℃加熱后,晶狀體內(nèi)部細胞膜流動性顯著增加,同時α,α的高分子聚集物(high molecular weight,HMW)和β晶狀體蛋白的含量下降。隨著加熱時間的延長,晶狀體內(nèi)部的GP值呈現(xiàn)與可溶性晶狀體蛋白含量一致的下降。
　　結(jié)論：晶狀體細胞膜流動性的改變與可溶性晶狀體蛋白含量的變化可能相關。
　　第三部分可溶性晶狀體蛋白與二氫鞘磷脂(dihydrosphingomyelin,DHSM)囊泡的結(jié)合實驗
　

8、　目的：研究品狀體細胞膜流動性與可溶性晶狀體蛋白是否存在直接聯(lián)系。
　　方法：用人晶狀體內(nèi)含量最高的磷脂成分DHSM制作0.1mg/ml囊泡溶液,并在實驗開始前1小時加入Laurdan標記。分別配制12.5,5,2.5,1.25mg/ml的α,β,γ晶狀體蛋白溶液,各取10μL與240μL囊泡混合后,最終晶狀體蛋白濃度分別為0.5,0.2,0.1,0.05mg/ml,結(jié)合半小時后,用熒光計測量各組GP值變化。
　　結(jié)果：隨著