Mab2112負(fù)性調(diào)節(jié)Bak抑制晶狀體上皮細(xì)胞凋亡.pdf

1、The Mab-21基因——從秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)中被最早鑒定出來(lái)的一個(gè)高度保守的基因，目前已鑒定出的Mab-21基因有兩個(gè):Mab-2111和Mab-2112。在脊椎動(dòng)物中，這兩個(gè)基因編碼的氨基酸序列存在90％以上的同源性，因此二者的功能也存在冗余和交叉現(xiàn)象。早期的研究發(fā)現(xiàn)Mab2112基因調(diào)控著原腸胚、神經(jīng)管的形成，在調(diào)節(jié)眼睛分化中也起著非常重要的作用。The Mab-2111的表達(dá)依賴(lài)于另一個(gè)重要的調(diào)節(jié)發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子——Pax6。Foxe

2、3是一個(gè)調(diào)節(jié)晶狀體發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子。在小鼠中敲除Mab-2111基因?qū)⑹笷oxe3基因表達(dá)水平顯著下調(diào)。本論文所關(guān)注的Mab-2112基因在脊椎動(dòng)物發(fā)育早期都有表達(dá)。Mab-2112基因還作為負(fù)性調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)Rx2以及視網(wǎng)膜生成過(guò)程中起著舉足輕重、不可替代的重要作用。
　　 本課題以HLE細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)材料，研究Mab-2112對(duì)HLE細(xì)胞凋亡的影響，主要實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下:
　　 1.用OA分別處理HLE-vec

3、tor和HLE-12兩種細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)。用血球計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并估算出處理24小時(shí)、48小時(shí)的凋亡率。HLE-vector細(xì)胞在處理24小時(shí)時(shí)凋亡率為約20％，而HLE-12只有10％左右。待處理到48小時(shí)HLE-vector達(dá)到60％，而HLE-12大概維持在30％。由此可以看到，雖然在OA處理后，HLE-vector細(xì)胞和HLE-12細(xì)胞的數(shù)目都有所減少，但HLE-L2細(xì)胞的凋亡速率一直低于HLE-vector細(xì)胞。

4、r>　　 2.對(duì)處理0小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)的兩種細(xì)胞進(jìn)行Hoechst染色，在熒光顯微鏡中可以觀(guān)察到，OA處理HLE-vector細(xì)胞6h時(shí)，凋亡比HLE-12較明顯，說(shuō)明HLE-12細(xì)胞相比于空載體細(xì)胞系HLE-vector凋亡延遲。流式結(jié)果顯示，到處理48小時(shí)時(shí)HLE-vector細(xì)胞已經(jīng)基本都處于凋亡的狀態(tài)，而HLE-12很多細(xì)胞雖然也呈現(xiàn)凋亡的狀態(tài)，但是仍有相當(dāng)一部分細(xì)胞存活。這在一定程度上，反應(yīng)出了Mab2112對(duì)細(xì)胞抗凋亡

5、的重要作用。
　　 3.利用RT-PCR技術(shù)和western blot技術(shù)，對(duì)內(nèi)源性凋亡途徑相關(guān)基因Bak的RNA水平和蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)RNA表達(dá)水平結(jié)果顯示:在對(duì)照系中，從6小時(shí)開(kāi)始，Bak的RNA水平即已開(kāi)始增加，24小時(shí)時(shí)表達(dá)量已經(jīng)非常高;而過(guò)表達(dá)系中Bak的RNA水平卻一直維持比較低的水平。這表明，Mab2112基因可以延遲Bak mRNA水平的表達(dá)。Western blot檢測(cè)蛋白水平

6、結(jié)果顯示:在HLE-12細(xì)胞中，OA處理后，Bak急劇下調(diào)，且一直維持在很低的表達(dá)水平;而在HLE-vector細(xì)胞中，Bak的表達(dá)一直維持很高的水平，在處理24小時(shí)時(shí)，表達(dá)水平達(dá)到最高。Western bolt結(jié)果表現(xiàn)出在蛋白水平上，Mab2112對(duì)Bak蛋白表達(dá)的強(qiáng)烈抑制作用。
　　 綜上所述，Mab2112基因可以抑制Bak的表達(dá)，而B(niǎo)ak蛋白在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到非常重要的作用，可以通過(guò)穿過(guò)線(xiàn)粒體外膜、改變其線(xiàn)粒體通