桿狀病毒VLF-1蛋白磷酸化位點(diǎn)功能研究.pdf

1、vlf-1是桿狀病毒的核心基因之一，是所有桿狀病毒中均存在的一個多功能基因。vlf-1編碼的蛋白質(zhì)VLF-1不僅介導(dǎo)桿狀病毒極晚期基因的表達(dá)，而且作為結(jié)構(gòu)蛋白定位在核衣殼的末端，參與病毒核衣殼組裝。缺失實(shí)驗表明，敲除vlf-1后病毒無法產(chǎn)生正常核衣殼，病毒失去感染性。
　　研究發(fā)現(xiàn)桿狀病毒HearNPV的病毒粒子中VLF-1蛋白有兩個絲氨酸位點(diǎn)被磷酸化。作為一種調(diào)控蛋白質(zhì)功能的重要手段，病毒和細(xì)胞蛋白的磷酸化在病毒與細(xì)胞的互作過程

2、中與病毒的生命周期密切相關(guān)。因此，推測VLF-1的磷酸化可能對其功能的發(fā)揮起重要作用。
　　序列比對發(fā)現(xiàn)在AcMNPV VLF-1的相同區(qū)域也存在兩個絲氨酸位點(diǎn)，由于該兩種病毒親緣關(guān)系較近，因此推測其與HearNPV VLF-1一樣也是潛在的磷酸化位點(diǎn)。本實(shí)驗通過對AcMNPV中VLF-1上兩個磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行突變來研究VLF-1的磷酸化位點(diǎn)的功能，為進(jìn)一步研究磷酸化在桿狀病毒AcMNPV的復(fù)制過程中的作用奠定了基礎(chǔ)，同時為其他病毒

3、的磷酸化位點(diǎn)研究提供參考。
　　本實(shí)驗使用PCR方法將VLF-1上兩個可能的磷酸化位點(diǎn)S218、S233突變成丙氨酸。在含有桿狀病毒AcMNPV穿梭質(zhì)粒的大腸桿菌中通過同源重組構(gòu)建vlf-1缺失型質(zhì)粒vlf-1-ko-AcBacmid。通過Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)將包含啟動子區(qū)的vlf-1基因以及定點(diǎn)突變的vlf-1基因插入vlf-1-ko-AcBacmid質(zhì)粒的polh基因座中構(gòu)建拯救及磷酸化位點(diǎn)突變型重組病毒質(zhì)粒。使用光學(xué)

4、顯微鏡、熒光顯微鏡以及電子顯微鏡觀察重組病毒在Sf9細(xì)胞中的復(fù)制情況，并通過繪制病毒一步生長曲線來定性分析VLF-1磷酸化位點(diǎn)突變對病毒復(fù)制的影響。最后，通過SDS-PAGE分析VLF-1磷酸化位點(diǎn)突變對極晚期基因polh表達(dá)的影響。
　　光學(xué)及熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，磷酸化位點(diǎn)突變的重組病毒可以在Sf9細(xì)胞中復(fù)制，并觀察到報告蛋白GFP表達(dá)以及熒光擴(kuò)散。但是沒有發(fā)現(xiàn)多角體的生成。一步生長曲線分析發(fā)現(xiàn)，磷酸化位點(diǎn)突變的重組病毒感染效率

5、比野生型大大降低。電鏡結(jié)果證實(shí)，在磷酸化位點(diǎn)突變的重組病毒粒子感染的Sf9細(xì)胞中存在大量不完全包裝的空管狀核衣殼。同時，正常包裝的核衣殼同樣出現(xiàn)在細(xì)胞中，這一部分包裝完全的病毒粒子保證了病毒的感染能力。SDS-PAGE分析表明，與野生型相比，VLF-1磷酸化位點(diǎn)突變的重組病毒所感染的細(xì)胞中，極晚期基因polh的表達(dá)水平大大降低。
　　實(shí)驗結(jié)果表明，VLF-1的磷酸化位點(diǎn)在桿狀病毒AcMNPV的復(fù)制過程中發(fā)揮了重要的作用。磷酸化位點(diǎn)