Mfn2基因PKA磷酸化位點的功能研究.pdf

1、第一部分去除PKA磷酸化位點對Mfn2基因調(diào)控細胞增殖和凋亡功能的影響
　　 1.目的
　　 研究大鼠線粒體融合素基因2（Mitofusin 2，Mfn2）在去除蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）磷酸化位點后對大鼠血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs）增殖和凋亡的影響及相關(guān)的信號通路。
　　 2.方法
　　 利用攜帶去除PKA磷酸化位點的

2、Mfn2重組腺病毒[Adv-Mfn2-PKA(△)]和攜帶Mfn2的重組腺病毒（Adv-Mfn2）感染大鼠VSMCs。激光共聚焦顯微鏡觀察其細胞內(nèi)定位；熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化；四甲基偶氮唑鹽（MTT）法比較其對細胞增殖的影響；細胞凋亡ELISA分析其對細胞凋亡的影響；Western blot法分析Mfn2-PKA（△）、Mfn2、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）和磷酸化Akt（p-Akt）蛋白的表達變化。
　　 3.結(jié)

3、果
　　 外源基因轉(zhuǎn)染后表達特異性蛋白產(chǎn)物；Mfn2-PKA（△）主要分布于線粒體上，與Mfn2相同；Mfn2-PKA（△）抑制VSMCs增殖、誘導VSMCs凋亡的作用較Mfn2顯著減弱（P＜0.01），與對照組無顯著差異；Mfn2-PKA（△）較Mfn2組p-ERK1/2表達顯著升高（P＜0.01），p-Akt表達也顯著升高（P＜0.01），與對照組無明顯差異。
　　 4.結(jié)論
　　 去除PKA磷酸化位點不影響

4、Mfn2在線粒體上的定位，但其調(diào)節(jié)VSMCs增殖和凋亡的作用消失，對ERK1/2和Akt信號通路也無抑制作用。表明PKA磷酸化位點對Mfn2調(diào)節(jié)VSMCs增殖和凋亡的功能有重要影響。
　　 第二部分Mfn2磷酸化位點突變體抑制細胞增殖作用的差異
　　 1.目的
　　 研究大鼠線粒體融合素2基因（Mitofusin 2，Mfn2）蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）磷酸化位點的狀態(tài)對大鼠VSMCs

5、增殖的影響及其相關(guān)的信號通路。
　　 2.方法
　　 利用攜帶PKA磷酸化位點突變的Mfn2重組腺病毒（Adv-Mfn2-S442A和Adv-Mfn2-S442D）和攜帶Mfn2的重組腺病毒（Adv-Mfn2），感染大鼠VSMCs。激光共聚焦法分析Mfn2及其突變體對線粒體形態(tài)的影響。細胞計數(shù)法、水溶性四甲基偶氮唑鹽（WST-1）法比較其對細胞增殖的影響；流式細胞術(shù)比較各組細胞周期的變化；Western blot法分析各

6、組Mfn2、磷酸化Raf-1（p-Raf-1）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白表達變化。建立大鼠頸動脈球囊損傷再狹窄模型，局部血管轉(zhuǎn)染Mfn2及突變體基因，HE染色觀察頸動脈內(nèi)膜增殖程度，免疫組化染色觀察增殖細胞核抗原（PCNA）的表達水平。
　　 3.結(jié)果
　　 外源基因轉(zhuǎn)染后表達特異性蛋白產(chǎn)物，Mfn2及其突變體均促進線粒體融合并聚集于核周。細胞實驗，Adv-Mfn2-S442A和Adv-Mfn2抑制細胞

7、增殖作用較對照組顯著增強（P＜0.01），停滯于G0/G1期細胞比例顯著增加（P＜0.01）；p-Raf-1和p-ERK1/2表達水平顯著降低（P＜0.01），且Adv-Mfn2-S442A作用更明顯（P＜0.01），而Adv-Mfn2-S442D組較對照組無顯著差異。動物實驗，Adv-Mfn2-S442A和Adv-Mfn2組大鼠頸動脈球囊損傷后內(nèi)膜增殖較對照組顯著減弱（P＜0.01），PCNA表達水平顯著減弱（P＜0.01），且Adv

8、-Mfn2-S442A作用更明顯（P＜0.01），而Adv-Mfn2-S442D組較對照組無顯著差異。
　　 4.結(jié)論
　　 去磷酸化的Mfn2通過ERK1/2信號通路抑制VSMCs增殖的作用較Mfn2更明顯；而磷酸化的Mfn2無顯著作用。PKA磷酸化位點的狀態(tài)對Mfn2調(diào)節(jié)VSMCs增殖有重要影響，并獨立于Mfn2促進線粒體融合的作用。
　　 第三部分Mfn2磷酸化位點突變體誘導細胞凋亡作用的差異
　　

9、 1.目的
　　 研究大鼠線粒體融合素2基因（Mitofusin 2，Mfn2）蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）磷酸化位點的狀態(tài)對大鼠VSMCs凋亡的影響及其相關(guān)的信號通路。
　　 2.方法
　　 利用攜帶PKA磷酸化位點突變的Mfn2重組腺病毒（Adv-Mfn2-S442A和Adv-Mfn2-S442D）和攜帶Mfn2的重組腺病毒（Adv-Mfn2），感染大鼠VSMCs。流式細胞術(shù)比較各組

10、細胞凋亡率的變化；JC-1染色法檢測線粒體膜電位變化；Western blot法分析各組Mfn2、磷酸化Akt（p-Akt）和活性半胱天冬酶9（cleaved caspase-9）蛋白表達變化。
　　 3.結(jié)果
　　 外源基因轉(zhuǎn)染后表達特異性蛋白產(chǎn)物。Adv-Mfn2-S442A和Adv-Mfn2誘導細胞凋亡的作用較對照組顯著增強（P＜0.01），線粒體膜電位顯著降低（P＜0.01），p-Akt表達水平顯著降低（P＜0.