Mfn2磷酸化修飾對(duì)其調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖功能的重.pdf

1、目的:
　　乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。線粒體融合蛋白2（Mitofusin2，Mfn2）是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，能抑制包括乳腺癌細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的增殖。本課題旨在利用人乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7，研究蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）介導(dǎo)的Mfn2蛋白第442位絲氨酸的磷酸化修飾對(duì)其調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖功能的重要性及相關(guān)機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法:

2、r>　　以人正常乳腺組織cDNA為模板，以pEGFP-N1質(zhì)粒為載體，分別構(gòu)建基因表達(dá)質(zhì)粒：含Mfn2開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）全長(zhǎng)的pEGFP-Mfn2質(zhì)粒和含去除第442位絲氨酸編碼DNA序列的Mfn2的ORF的pEGFP-Mfn2-PKA(△)質(zhì)粒。將實(shí)驗(yàn)分為4組，Mock組（未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照）、N1組（轉(zhuǎn)染pEGFP-N1）、Mfn2組（轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn2）和Mfn2-PKA(△)組（轉(zhuǎn)染pE

3、GFP-Mfn2-PKA(△)）。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后，用熒光顯微鏡檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染效率，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（RT-qPCR）和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Mfn2的mRNA及蛋白表達(dá)水平，以確定Mfn2是否在MCF-7細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)錄并翻譯。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT法評(píng)估轉(zhuǎn)染后72h內(nèi)的細(xì)胞增殖情況；利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后細(xì)胞周期分布情況。用western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后在血清刺激下磷酸化ERK1/

4、2（Phosphorylation extracellular regulated protein kinases1/2, p-ERK1/2）的蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　從人乳腺組織中擴(kuò)增出全長(zhǎng)為2274bp的Mfn2基因，然后突變得到長(zhǎng)為2271bp的Mfn2-PKA(△)基因。構(gòu)建相應(yīng)的基因表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-Mfn2和pEGFP-Mfn2-PKA(△)，經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)與GenBank中ORF序列相符，證明質(zhì)粒構(gòu)建

5、成功。轉(zhuǎn)染48h后，熒光顯微鏡顯示，N1組、Mfn2組、Mfn2-PKA(△)組都表達(dá)綠色熒光蛋白，證明轉(zhuǎn)染成功且效率均約為60％。RT-qPCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，與N1組和Mock組相比，Mfn2-PKA(△)組和Mfn2組中 Mfn2的mRNA水平顯著升高（P<0.05），且 Mfn2-PKA(△)組和Mfn2組之間無(wú)顯著差異（P>0.05）。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示：Mfn2和Mfn2-PKA(△)的蛋白產(chǎn)物均定位在細(xì)胞質(zhì)，與N1

6、組和Mock組相比，Mfn2-PKA(△)組和Mfn2組的Mfn2蛋白水平顯著升高（P<0.05），且 Mfn2-PKA(△)組和Mfn2組之間無(wú)顯著差異（P>0.05）。細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染48h、72h后，Mfn2-PKA(△)組的細(xì)胞增殖能力均與 N1組和Mock組相似（P>0.05），顯著高于 Mfn2組（P<0.05）。流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果顯示：Mfn2組的細(xì)胞周期多阻滯在 G1期，與之相比，Mfn2-PKA(△

7、)組的G1期細(xì)胞顯著減少（P<0.05），細(xì)胞周期分布與 N1組和Mock組相似（P>0.05）。Western blot的結(jié)果顯示：各組中ERK1/2的蛋白水平一致，而Mfn2-PKA(△)組的p-ERK1/2蛋白水平與 N1組和Mock組相似（P>0.05），顯著高于Mfn2組（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　在MCF-7細(xì)胞內(nèi)，外源性的Mfn2和Mfn2-PKA(△)在 mRNA和蛋白水平都能成功轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。Mfn2