Caveolin-1調(diào)控HER-2活化對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分:Caveolin-1在乳腺癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的相關(guān)性
　　目的:
　　本研究擬應(yīng)用免疫組化、體外培養(yǎng)細(xì)胞、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、免疫蛋白印跡等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，探討Caveolin-1參與乳腺癌的作用及其可能機(jī)制，從細(xì)胞、組織和分子水平綜合分析Caveolin-1對(duì)HER-2磷酸化的調(diào)控，探討Caveolin-1在Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路中的作

2、用，為闡明乳腺癌發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為有效預(yù)防和治療乳腺癌提供新的靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.采用非生物素酶二步(PV)免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)50例分化程度不同的浸潤(rùn)性乳腺癌組織及正常乳腺組織中Caveolin-1的表達(dá)，探討其與乳腺癌臨床生物學(xué)行為的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的意義。
　　2.了解Caveolin-1和磷酸化人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(p-HER-2)的表達(dá)情況，以正常乳腺組織或乳腺良性增生為陰性對(duì)照。
　

3、　結(jié)果:
　　1.免疫組化檢測(cè)Caveolin-1、HER-2、Ki-67在乳腺癌組織中的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，Caveolin-1的陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物主要分布于乳腺上皮細(xì)胞的胞漿，呈現(xiàn)黃色-棕褐色顆粒。按判定標(biāo)準(zhǔn)Caveolin-1在正常乳腺組織中陽(yáng)性表達(dá)的程度較強(qiáng)，在浸潤(rùn)性乳腺癌組織中表達(dá)較少，其表達(dá)率分別為80％和32％，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ki-67的陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物主要分布于乳腺上皮細(xì)胞的胞核，HER-2的

4、陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物主要分布于乳腺上皮細(xì)胞的胞膜，呈現(xiàn)黃色-棕褐色顆粒。
　　2.Caveolin-1、HER-2、 Ki-67的表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Caveolin-1在浸潤(rùn)性乳腺癌中的表達(dá)水平隨淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移而減低(P＜0.05)，隨臨床TNM分期而減低(P＜0.05)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Caveolin-1在浸潤(rùn)性乳腺癌中的表達(dá)水平與患者年齡、腫瘤直徑、ER/PR、HER-2、Ki-67、及絕經(jīng)前

5、后等表達(dá)無(wú)關(guān)。
　　第二部分：Caveolin-1影響乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的的分子機(jī)制
　　目的：
　　探討Caveolin-1影響乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的的分子機(jī)制
　　方法:
　　1.細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)
　　將MDA-MB-453細(xì)胞凍存管從液氮中取出，融化后用含10％胎牛血清、青霉素100IU/ml、鏈霉素100IU/ml的1640培養(yǎng)基在37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.質(zhì)粒提取<

6、br>　　用QIAGEN質(zhì)粒提取試劑盒，分別提取pcDNA3.1-Cav1和pcDNA3.1陰性對(duì)照質(zhì)粒，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。設(shè)置MDA-MB-453組、pcDNA3.1-Cav1（Cav-1）轉(zhuǎn)染組和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染對(duì)照組，加嘌呤霉素進(jìn)行抗性篩選，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞全部死亡。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Cav1質(zhì)粒的MDA-MB-453細(xì)胞即MDA-MB-453/Cav-1，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒的MDA-MB-453細(xì)胞即MDA-MB-45

7、3/pcDNA3.1。
　　3.Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證過(guò)表達(dá)Caveolin-1效果
　　培養(yǎng)MDA-MB-453、MDA-MB-453/Cav-1和MDA-MB-453/pcDNA3.1細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至培養(yǎng)皿的80％左右，用無(wú)胎牛血清的1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)4小時(shí)，收集細(xì)胞提取總蛋白，采用免疫印跡(Western-blot)法測(cè)定不同乳腺癌細(xì)胞中Caveolin-1蛋白的表達(dá)情況。
　　將MD

8、A-MB-453/Cav-1細(xì)胞MDA-MB-453/pcDNA3.1細(xì)胞和MDA-MB-453細(xì)胞分別接種于35mm培養(yǎng)皿中，利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Caveolin-1 mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.乳腺癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞MDA-MB-453的Caveolin-1表達(dá)情況
　　1.1Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞Caveolin-1的蛋白表達(dá)水平Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MDA-

9、MB-453細(xì)胞Caveolin-1的蛋白水平。MDA-MB-453、MDA-MB-453/pcDNA3.1和MDA-MB-453/Cav-1細(xì)胞Caveolin-1的表達(dá)水平分別為0.02±0.00，0.02±0.00，0.60±0.03，MDA-MB-453/Cav-1細(xì)胞Caveolin-1的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　1.2實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Caveolin-1的mRNA的表達(dá)水平
　

10、　實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MDA-MB-453穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞Caveolin-1 mRNA的表達(dá)水平。MDA-MB-453、MDA-MB-453/pcDNA3.1和MDA-MB-453/Cav-1細(xì)胞Caveolin-1的mRNA表達(dá)水平分別為1.00±0.00、1.12±0.05、7.09±0.43，MDA-MB-453/Cav-1細(xì)胞Caveolin-1的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(1.00)，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　

11、　2.乳腺癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞MDA-MB-453的增殖情況
　　將乳腺癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞MDA-MB-453接種于96孔板，分別經(jīng)0nM、4nM、20nM、100nM刺激后，MTT法檢測(cè)各孔的OD值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，MDA-MB-453/Cav-1組的OD值為0.80±0.07，0.86±0.03，0.93±0.03，1.00±0.03，均明顯低于對(duì)照組的OD值0.93±0.05，1.02±0.04，1.12±0.06，1.32±0.09，有

12、顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　第三部分：Caveolin-1對(duì)乳腺癌細(xì)胞HER-2活化的影響
　　目的：
　　探討Caveolin-1對(duì)乳腺癌細(xì)胞HER-2活化的影響
　　方法:
　　Western blot檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的Caveolin-1、4G10、HER-2、p-Akt、Akt、p-ERK、ERK、β-actin的蛋白表達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)分為兩組:pcDNA3.1-Cav1轉(zhuǎn)染組和p

13、cDNA3.1轉(zhuǎn)染對(duì)照組，培養(yǎng)并用嘌呤霉素篩選乳腺癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDA-MB-453/pcDNA3.1和MDA-MB-453/Cav-1細(xì)胞，每組分別于EGF刺激0min、5min、10min、30min后收集細(xì)胞，提取蛋白，Western-blot檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)Caveolin-1、4G10、HER-2、p-Akt、Akt、p-ERK、ERK、β-actin蛋白的表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:
　　過(guò)表達(dá)Caveolin-1對(duì)

14、乳腺癌細(xì)胞HER-2活化的影響
　　統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，pcDNA3.1-Cav1組各時(shí)間點(diǎn)Caveolin-1的表達(dá)水平（1.12±0.03，1.08±0.06，1.13±0.06，1.11±0.04）均明顯高于對(duì)照組(0.05±0.01，0.04±0.01，0.04±0.00，0.04±0.01)的表達(dá)水平，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);pcDNA3.1-Cav1組磷酸化HER-2分別于EGF刺激5min、10min、30min后

15、的表達(dá)水平（0.98±0.04，0.50±0.03，0.20±0.01）均明顯低于對(duì)照組（1.25±0.03，1.07±0.03，0.50±0.02）的表達(dá)水平，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);pcDNA3.1-Cav1組磷酸化Akt分別于EGF刺激5min、10min、30min后的表達(dá)水平（0.50±0.01，0.67±0.03，0.42±0.01）均明顯低于對(duì)照組（0.85±0.05，1.20±0.08，0.82±0.04）的表達(dá)

16、水平，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);pcDNA3.1-Cav1組磷酸化ERK分別于EGF刺激5min、10min、30min后的表達(dá)水平（0.58±0.01，0.80±0.03，0.45±0.01）均明顯低于對(duì)照組（0.93±0.02，1.10±0.06，0.72±0.05）的表達(dá)水平，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.Caveolin-1在正常乳腺上皮細(xì)胞高表達(dá);Caveolin-1在浸潤(rùn)性乳腺癌組織