蒲公英多糖對乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　本課題通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究蒲公英多糖(Polysaccharide from T.mongolicum，PTM)對乳腺癌生物學(xué)行為的影響，旨在明確蒲公英多糖抗乳腺癌的作用機(jī)制，從而為其應(yīng)用于臨床乳腺癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　(1)采用超聲法初步提取蒲公英多糖，同時(shí)計(jì)算蒲公英多糖的產(chǎn)率。隨后，運(yùn)用高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC

2、）進(jìn)行進(jìn)一步提取，分別設(shè)置提取溫度(40℃、50℃、60℃)，液固比(6mL/g、12mL/g、18mL/g)和提取時(shí)間(30min、40min、50min)三個(gè)變量進(jìn)行HPLC，采用中心組合實(shí)驗(yàn)(box-behnken design，BBD)分析三個(gè)變量（提取溫度，液固比和提取時(shí)間）對蒲公英多糖(polysaccharides from T.mongolicum，PTM)提取率的影響。
　　(2)將0(DMSO)、25、50、1

3、00、200、400μg/mL蒲公英多糖分別作用于MCF-7細(xì)胞，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的生長情況，MTT法檢測細(xì)胞的增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率，western blot法檢測細(xì)胞中P53、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)。
　　(3)建立乳腺癌MCF-7細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型。將50只移植瘤小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只:Control組（經(jīng)胃給予0.9％生理鹽水）、Capecitabine組（經(jīng)胃給予卡培他濱）、20mg/kg

4、 PTM組（胃給予20mg/kg蒲公英多糖）、40mg/kg PTM組（經(jīng)胃給予40mg/kg蒲公英多糖）、80mg/kg PTM組（經(jīng)胃給予80mg/kg蒲公英多糖）。各組裸鼠經(jīng)胃給藥21天后處死，期間每3天運(yùn)用游標(biāo)卡尺測量各組裸鼠移植瘤的長度以及寬度，計(jì)算腫瘤體積。各組裸鼠經(jīng)胃給藥21天后采用頸椎脫臼法處死裸鼠，取移植瘤稱重。運(yùn)用免疫組化法檢測各組移植瘤組織中P53、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　(1)模

5、型適應(yīng)性分析結(jié)果顯示，PTM的提取率在3.12～4.65％之間，在提取溫度60℃，液固比18∶1，提取時(shí)間40min時(shí)達(dá)到最高。所建立的模型具有顯著性(P＜0.0001，F(xiàn)=573.3965)。高的R2(0.9986)和R2adj(0.9969)表明模型有較好的擬合度。相對變異系數(shù)(CV)值為0.7652表明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有較高的精密度和良好的可靠性。此外，單因素變量A，B，C，交互變量AB，AC，BC和二次方變量A2，B2，C2均顯著影響P

6、TM的提取率(P＜0.05)。最佳的提取條件通過軟件得出:提取溫度58.17℃，液固比15.03∶1，提取時(shí)間44.12min，在這個(gè)條件下的多糖提取得率的預(yù)測值為4.84％。為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整為:提取溫度58.2℃，液固比15∶1，提取時(shí)間44.12min。在這個(gè)條件下提取PTM得率為4.86±0.13％。結(jié)果表明響應(yīng)面法用于提取PTM條件的優(yōu)化是有效和合適的。
　　(2)克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著蒲公英多糖濃度

7、的升高，軟瓊脂中克隆形成數(shù)量逐漸下降;與0μg/mL組相比，當(dāng)蒲公英多糖濃度為50、100、200、400μg/mL時(shí)克隆形成數(shù)量明顯降低(P＜0.05)。MTT法檢測結(jié)果表明，隨著蒲公英多糖濃度的升高，MCF-7細(xì)胞的增殖活性逐漸降低;與0μg/mL組相比，當(dāng)蒲公英多糖濃度為50、100、200、400μg/mL時(shí)MCF-7細(xì)胞的增殖活性明顯降低(P＜0.05)。隨著蒲公英多糖作用時(shí)間的延長，MCF-7細(xì)胞的增殖活性逐漸降低，與0h時(shí)

8、相比顯著降低(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，隨著蒲公英多糖濃度的升高，細(xì)胞凋亡數(shù)量逐漸增多;與0μg/mL組相比，當(dāng)蒲公英多糖濃度為50、100、200、400μg/mL時(shí)細(xì)胞凋亡的數(shù)量明顯增多(P＜0.05)。western blot檢測結(jié)果表明，隨著蒲公英多糖濃度的升高，MCF-7細(xì)胞中P53蛋白的表達(dá)水平逐漸增高，蒲公英多糖各濃度組細(xì)胞中P53蛋白的含量與control組相比明顯上升(P＜0.05)。隨著蒲公英多糖濃度的

9、升高，MCF-7細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)水平逐漸增高，蒲公英多糖各濃度組細(xì)胞中Bax蛋白的含量與control組相比發(fā)生明顯上調(diào)(P＜0.05)。隨著蒲公英多糖濃度的升高，MCF-7細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平逐漸降低，蒲公英多糖各濃度組細(xì)胞中Bcl-2蛋白的含量與control組相比明顯減少(P＜0.05)。
　　(3)將人乳腺癌MCF-7細(xì)胞接種至裸鼠右肩甲皮下第8天時(shí)，裸鼠該部位即可見有黃豆大小的移植瘤，本實(shí)驗(yàn)中50只裸鼠均

10、全部成瘤。在裸鼠成瘤之后，各組裸鼠在進(jìn)食和飲水上均為正常，大小便亦未發(fā)生異常。各組裸鼠的精神狀態(tài)良好，活動(dòng)正常，反應(yīng)迅速。各組裸鼠膚色正常、移植瘤組織未發(fā)生破潰。上述結(jié)果表明乳腺癌MCF-7移植瘤裸鼠模型構(gòu)建成功。各時(shí)間點(diǎn)Capecitabine組、20、40、80mg/kg PTM組裸鼠移植瘤體積均明顯小于Control組(P＜0.05)。與Capecitabine組相比，40mg/kg PTM組和80mg/kg PTM組各時(shí)間點(diǎn)裸鼠

11、移植瘤體積明顯減小(P＜0.05)。而40mg/kg PTM組與80mg/kg PTM組各時(shí)間點(diǎn)裸鼠移植瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與Control組相比，Capecitabine組、20、40、80mg/kgPTM組裸鼠移植瘤重量均明顯減輕(P＜0.05)。與Capecitabine組相比，80mg/kg PTM組裸鼠移植瘤重量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。P53蛋白染色的陽性部位主要分布于裸鼠移植瘤細(xì)胞核中，呈棕黃色顆粒

12、狀。與Control組相比，20、40、80mg/kg PTM組裸鼠移植瘤組織中P53蛋白的表達(dá)水平明顯的增高(P＜0.05);隨著PTM作用濃度的升高，P53蛋白的表達(dá)量也逐漸升高。Bax蛋白的染色陽性部位定位于裸鼠移植瘤的細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒狀。與Control組相比，20、40、80mg/kg PTM組裸鼠移植瘤組織中Bax蛋白的表達(dá)水平明顯的增高(P＜0.05);隨著PTM作用濃度的升高，Bax蛋白的表達(dá)量也逐漸升高。Bcl-2