p90-CIP2A在乳腺癌中的免疫診斷價值及其對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、乳腺癌是女性患者中最普遍的腫瘤之一，并且在發(fā)達國家中是由于癌癥導致死亡的第二大原因。雖然近年來，通過影像學的檢測使乳腺癌的早期診斷有所改善，但是在許多國家中，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率仍然呈上升趨勢。因此，篩選和鑒定有價值的生物標志物可以提高乳腺癌的診斷率以及預防乳腺癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移，同時發(fā)現(xiàn)新的治療靶點對于有效地控制侵襲性乳腺癌也是極其重要的。
　　蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of prote

2、in phosphatase2A，CIP2A），也稱為KIAA1524或者p90腫瘤相關抗原，是一個新發(fā)現(xiàn)的癌蛋白。據(jù)報道，它在人類腫瘤中通過穩(wěn)定致癌性轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的表達，抑制蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase2A，PP2A）的活性。在一些惡性腫瘤細胞中，下調(diào)p90/CIP2A的表達可以降低腫瘤細胞的增殖能力，并且減小異種移植腫瘤的生成。雖然p90/CIP2A在許多腫瘤中呈現(xiàn)高表達，并且其表達水平與某些腫瘤的預

3、后相關，但是目前還沒有完全揭示p90/CIP2A蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的功能和機制。
　　首先，本研究欲探討抗p90/CIP2A自身抗體是否可以作為診斷乳腺癌的生物標志物，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）在168例乳腺癌血清和88例正常人血清中檢測抗p90/CIP2A自身抗體的陽性率。采用間接免疫熒光技術（indirect immunofluorescence a

4、ssay，IIF）測定p90/CIP2A在HEp-2細胞中的定位。其次，通過免疫組織化學實驗（immunohistochemistry， IHC）在46例乳腺癌組織和46例乳腺癌旁組織中檢測p90/CIP2A蛋白的表達。此外，本課題欲研究 p90/CIP2A在乳腺癌中的生物功能和相關機制。構建p90/CIP2A shRNA表達載體，通過慢病毒法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩株三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231和 LM2-4。然后，通過 MTT、克隆形成實

5、驗和流式細胞儀檢測p90/CIP2A對細胞增殖能力和凋亡作用的影響，并初步測定其主要信號通路的分子磷酸化水平。
　　目的:
　　1基于臨床患者和正常人群的血清和組織樣本，本研究欲探討抗p90/CIP2A抗體是否可以作為乳腺癌的免疫診斷標志物。
　　2通過構建慢病毒介導的 shRNA抑制 p90/CIP2A表達的體外細胞模型，檢測p90/CIP2A在乳腺癌細胞中的生物學功能及相關機制。
　　材料與方法:
　　

6、1研究對象
　　1.1血清及組織樣本：本研究中所采用的168例乳腺癌患者血清和88例正常人血清來自美國德州大學艾爾帕索分校（University of Texas，El Paso，UTEP）腫瘤免疫研究室的血清庫。血清樣本最初由本研究的臨床醫(yī)院合作方提供，均經(jīng)病人知情同意。乳腺癌血清是在病理診斷后采集的，未經(jīng)化療或放療。對照組血清是通過同期健康體檢采集的，且沒有任何腫瘤的癥狀。本研究經(jīng)UTEP評價委員會和合作機構同意。組織芯片購于

7、Biomax公司，包括46例乳腺癌組織和46例乳腺癌旁組織。
　　1.2細胞系：SK-BR-3、MCF10A和293T細胞購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。其他細胞系MDA-MB-231，LM2-4， T-47D和ZR-75-1由UTEP的Giulio Francia教授惠贈。
　　2方法
　　2.1通過ELISA、Western blotting和

8、IIF，檢測p90/CIP2A在乳腺癌血清和正常人血清中的免疫反應。通過IHC，檢測p90/CIP2A在乳腺癌組織和乳腺癌旁組織中的表達。
　　2.2 shRNA慢病毒載體介導的p90/CIP2A基因沉默后，通過MTT、克隆形成實驗和流式細胞儀，檢測p90/CIP2A對乳腺癌細胞增殖能力和凋亡作用的影響。通過Western blotting檢測細胞中的c-Myc蛋白的表達和ERK1/2磷酸化水平。
　　3統(tǒng)計分析
　　

9、使用IBM SPSS21.0統(tǒng)計軟包（SPSS Inc， USA）對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有檢驗水準α=0.05。ELISA和 IHC中兩個率的比較采用χ2檢驗。采用 ROC曲線評價抗 p90/CIP2A自身抗體對乳腺癌的免疫診斷價值。MTT、克隆形成實驗和凋亡檢測中數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用兩個獨立樣本t檢驗。
　　結(jié)果:
　　1抗p90/CIP2A自身抗體在乳腺癌病人血清中的陽性率
　　抗 p90/CIP2A自

10、身抗體在乳腺癌血清中的陽性率（19.1％）高于正常血清（2.3%），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。此外，ELISA結(jié)果通過Western blotting進一步驗證。
　　2 p90/CIP2A在HEp-2細胞中的熒光定位
　　本研究通過IIF檢測，抗p90/CIP2A自身抗體表達陽性血清的免疫熒光染色定位在胞漿。通過預吸收實驗，用純化的 p90/CIP2A蛋白與同一個血清中的抗p90/CIP2A自身抗體結(jié)合，胞漿的熒

11、光染色降低。
　　3 p90/CIP2A在乳腺癌組織中和乳腺癌旁組織中的表達
　　p90/CIP2A在乳腺癌組織中的陽性表達(100%)高于乳腺癌旁組織（28%），統(tǒng)計學分析有差異（P<0.001）。
　　4 RNA干涉抑制p90/CIP2A在乳腺癌細胞中穩(wěn)定表達模型的建立
　　本研究利用MDA-MB-231和 LM2-4兩株三陰性乳腺癌細胞作為RNA干涉抑制p90/CIP2A穩(wěn)定表達的細胞模型。shRNA沉默p

12、90/CIP2A后，在兩株細胞中，p90/CIP2A的表達降低。
　　5在乳腺癌細胞中沉默p90/CIP2A的表達進而抑制細胞增殖和細胞克隆形成
　　在兩株乳腺癌細胞中降低p90/CIP2A的表達可以抑制乳腺癌細胞的增殖，統(tǒng)計學分析有差異（P<0.05）。與MTT結(jié)果一致，抑制p90/CIP2A的表達，降低腫瘤細胞克隆形成能力，有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。
　　6 p90/CIP2A的缺失促進由紫杉醇誘導乳腺癌細胞的

13、凋亡作用
　　p90/CIP2A shRNA組中早期凋亡和晚期凋亡率的總和高于對照組，有統(tǒng)計學差異（P<0.05），進而表明在乳腺癌細胞中抑制p90/CIP2A的表達可以增強由紫杉醇誘導的細胞凋亡作用。
　　7抑制p90/CIP2A的表達下調(diào)c-Myc的表達，且降低ERK1/2磷酸化
　　Western blotting結(jié)果顯示在兩株乳腺癌細胞系中，抑制p90/CIP2A的表達， c-Myc蛋白的表達降低，并且ERK1