Galectin-3siRNA和pIRES-IL-24-TRAIL的構(gòu)建及其對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、研究背景和目的：
　　 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。在我國占全身各種惡性腫瘤的7％～10％。近年來在我國，特別是在一些大城市及沿海經(jīng)濟發(fā)展較快的地區(qū)，發(fā)病率呈迅速上升趨勢，是危害婦女健康的主要疾病?；厥走^去的二十年，乳腺癌的診治取得了長足的進展，尤其是在外科治療方面的發(fā)展取得了較好的效果。與此同時，對乳腺癌生物學行為的認識也不斷深入，利用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進行了進一步的闡述，針對乳腺癌的預(yù)后，尤其是已發(fā)生

2、侵襲轉(zhuǎn)移的晚期患者預(yù)后較差，侵襲轉(zhuǎn)移機制亦已成為當今的研究熱點。眾所周知，惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是個多因素、多步驟的進展過程，但其具體機制仍不清楚。
　　 全世界每年約有120萬婦女患上乳腺癌，占所有女性腫瘤的18％，其中超過17萬的患者是三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)，占乳腺癌患者的10％-23.8％。TNBC具有侵襲性強、復(fù)發(fā)早、進展快、生存時間短等特殊臨床生物學行為，且對大

3、多數(shù)內(nèi)分泌治療及乳腺癌的靶向治療（針對HER-2過表達和雌孕激素受體表達陽性）不敏感，預(yù)后較其他類型乳腺癌差。傳統(tǒng)的腫瘤治療模式（手術(shù)、放療、化療）依然是目前腫瘤治療的主要手段。然而，隨著對腫瘤細胞生長、增殖、凋亡的分子機制研究的深人，伴隨著分子生物學革命性的進展，腫瘤的治療已進人生物治療時代，使人類靶向性治療腫瘤成為可能。靶向治療用腫瘤細胞可以表達，而正常細胞很少或不表達的特定基因或基因的表達產(chǎn)物，形成相對或絕對靶向，最大限度地殺傷腫

4、瘤細胞，而對正常細胞損傷很小的治療方法。乳腺癌分子靶向治療是指針對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的癌基因及其相關(guān)表達產(chǎn)物進行治療。用于治療乳腺癌的分子靶向藥物通過阻斷腫瘤細胞或相關(guān)細胞的信號轉(zhuǎn)導，來控制細胞基因表達的改變，而產(chǎn)生抑制或殺死腫瘤細胞。由于三陰乳腺癌組織學分級較差，不表達ER，PR和HER-2，且多伴有p53突變、EGFR的表達，目前較常用的分子靶向藥物不針對這個亞型，盡管該亞型對新輔助化療有較高的總反應(yīng)率和病理緩解率，但總體預(yù)后仍為

5、最差。目前尚無TNBC的治療指南，其治療一般按常規(guī)治療標準進行。近年來，許多研究者啟動了多個國際、多中心臨床研究，認為三陰乳腺癌主要選擇紫杉類、鉑類、蒽環(huán)類及分子靶向治療藥物。目前尋找TNBC的新治療靶點是當今世界研究的難點和熱點。
　　 近年有多項研究表明抑制Galectin-3表達可以影響腫瘤細胞的增殖凋亡，鮮有針對乳腺癌尤其是三陰性乳腺癌的研究。Galectin-3是一種半乳糖苷結(jié)合蛋白，屬于凝集素家族，它在細胞與細胞間及

6、細胞基質(zhì)相互作用、細胞生長、細胞周期調(diào)控、細胞凋亡、細胞損傷和修復(fù)過程，腫瘤轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移等過程中扮演了一個重要角色。近年來，幾項研究證明了Galectin-3在人類腫瘤中過度表達，包括大細胞淋巴瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌、腦部腫瘤、黑色素瘤、甲狀腺癌。Survivin是一個調(diào)亡抑制基因，具有調(diào)節(jié)細胞增殖和調(diào)亡的能力，位于人類染色體17q25，有4個外顯子和3個內(nèi)含子，編碼全長1417kb。研究發(fā)現(xiàn)Survivin表達在所有常見的人類腫瘤內(nèi)

7、，從35％的胃癌患者到幾乎100％的惡性黑色素瘤患者中均可檢測到。在大多數(shù)病例中，Survivin的表達預(yù)示著較差的預(yù)后。Survivin主要表達于胚胎、發(fā)育的胎兒組織和大多數(shù)腫瘤組織內(nèi)，而不表達于成熟的正常組織。Ki-67表達在細胞周期的所有階段除了G0，它可以用來評估生物行為和增殖活性的細胞。這種過度表達的Ki-67已經(jīng)被觀察到在許多惡性腫瘤。自從1980年代早期被發(fā)現(xiàn)以來，Ki-67一直是腫瘤增殖標志物的研究熱點，尤其在淋巴瘤、乳

8、腺癌、內(nèi)分泌和腦癌。它常作為一個補充的分級系統(tǒng)，包括提示增殖信號的有絲分裂計數(shù)。Ki-67是Oncotype評分中的五個擴散基因之一，此外還有16個癌癥相關(guān)基因，共同檢測腫瘤復(fù)發(fā)。本課題首先從半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、生存蛋白(Survivin)、Ki-67的角度研究乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制，以指導臨床上的診斷、分類、預(yù)后和治療。本實驗接著從RNA干擾的角度探討經(jīng)過干擾后Galectin-3與三陰性乳腺癌增殖和凋亡的關(guān)系，了

9、解Galectin-3在三陰性乳腺癌中的生物學作用，為其能否作為三陰性乳腺癌的基因診斷和治療的靶點提供依據(jù)。
　　 此外，乳腺癌5年生存率約50～60％，近50％患者治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，而晚期乳腺癌患者平均生存時間僅18～30個月。治療乳腺癌雖然有多種方案可選擇，然而預(yù)后均不理想，副作用大，且乳腺癌易乳腺外轉(zhuǎn)移，因而成為治療上最困難的腫瘤之一。傳統(tǒng)的治療方法僅能殺死腫瘤細胞中處于分裂期的細胞，一旦治療停止，腫瘤干細胞仍會繼續(xù)增殖和分

10、化，導致腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，這就是“蒲公英”現(xiàn)象。2003年，A(l)-Hajj等在乳腺癌患者的原發(fā)病灶中進行了分子標記，發(fā)現(xiàn)具有CD44+/CD24-/Lineage-表型的乳腺癌細胞在免疫缺陷動物模型中具有顯著的致瘤能力，其移植瘤的細胞組成與原發(fā)灶腫瘤相同，在經(jīng)過多代細胞培養(yǎng)之后，還具有較強的致瘤性，提示這類細胞具有與乳腺干細胞類似的自我更新和分化的本質(zhì)，將其稱為乳腺癌干細胞。乳腺癌干細胞(breast cancer stem cel

11、ls，BCSCs)，BCSCs被認為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展與維持的基礎(chǔ)，與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和對治療的耐受有關(guān)。目前研究認為只有少數(shù)BCSCs進入細胞周期，而多數(shù)BCSCs處于靜止狀態(tài)，故BCSCsRg常規(guī)的化療藥物并不敏感?，F(xiàn)有的物理、化學藥物治療手段所針對的是大多數(shù)的腫瘤細胞，對腫瘤中少數(shù)的BCSCs無法達到最有效的殺滅效果，不能防止惡性腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，而腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因?，F(xiàn)有的乳腺癌治療方法多旨在盡可能殺死或清除一切

12、腫瘤細胞，但是對存在于腫瘤中的數(shù)量稀少的干細胞樣細胞群卻作用甚微，治療后殘存腫瘤干細胞的增殖，足以促使腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。乳腺癌干細胞高表達表面標志物CD44、ABC蛋白、MDR、ABCG2等，但是目前尚未找到特異性的靶向治療標志物。
　　 目前，乳腺癌干細胞的靶向治療研究主要有:(1)DNA損傷修復(fù)阻斷劑，如ADP核糖聚合酶1(PARPI)阻斷劑;(2)細胞表面受體，如EGFR、C-Kit;(3)血管表皮生長因子受體vascula

13、r endothelial growth factor(VEGF) receptor抑制劑;(4)Src激酶抑制劑;(5)哺乳類動物雷帕霉素靶蛋白mammalian target ofrapamycin(roTOR);(6)白細胞介素IL;(7)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體tumornecrosis factor-related apoptosis inducing ligand(TRAIL)等。人類黑色素瘤分化相關(guān)基因-7/白介素-2

14、4(Melanoma diffrentiation-associated gene-7/interleukin-24，MDA-7/IL-24)是一個新型的、具有細胞因子樣特性的腫瘤抑制基因，是IL-10細胞因子家族的新成員。它編碼分泌型蛋白產(chǎn)物(secreted MDA-7/IL-24 protein，sMDA-7/IL-24)，與免疫系統(tǒng)的白介素功能相同，并具有抑制腫瘤生長及特異性誘導腫瘤細胞凋亡的能力。目前的實驗研究表明IL-24在

15、抑制和分化腫瘤細胞，促進腫瘤細胞凋亡;同時抑制腫瘤周圍血管形成;增強腫瘤細胞對放療、化療的敏感性;抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用。IL-24具有多效性、選擇性、重疊性、協(xié)同性、拮抗性和網(wǎng)絡(luò)性雙重性作用特點。但在研究中發(fā)現(xiàn)IL-24并不能完全消滅種植在裸鼠身上的腫瘤。解決這一問題的方法有二種:(1)與其他細胞因子聯(lián)合;(2)使細胞因子可以穩(wěn)定高效地表達作用在腫瘤部位。有報道指IL-24能誘導并增強腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體

16、(Tumor NecrosisFactor-related related apoptosis inducing ligand，TRAIL)的活性。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(Tumor necrosis factor-Related Apoptosis Inducing Ligand，TRAIL)或稱凋亡素2配體(Apo-2 ligand，Apo2L)是由Wiley等從人心肌cDNA文庫中克隆出來的，因其氨基酸順序具有TNF超家族的

17、結(jié)構(gòu)特征并能誘導Jurkat細胞和EB病毒轉(zhuǎn)化的人類淋巴細胞凋亡而得名，因其能誘導不同來源的腫瘤細胞以及病毒轉(zhuǎn)化的細胞發(fā)生凋亡，而對正常組織細胞不具有毒性，不會導致正常細胞發(fā)生凋亡，同時與其它抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用能協(xié)同殺傷腫瘤細胞，所以成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點，是一種新型的抗腫瘤藥物。目前的研究認為TRAIL主要通過位于細胞膜的死亡受體DR4和DR5通過其胞外區(qū)與TRAIL結(jié)合后活化，其胞內(nèi)死亡功能域DD傳導凋亡信號，活化了細胞內(nèi)的FA

18、DD-caspase途徑，激活線粒體非依賴性和線粒體依賴性二種途徑介導凋亡的發(fā)生。本課題最后擬重組構(gòu)建IL-24-TRAIL的基因載體，嘗試解決細胞因子在治療乳腺癌干細胞中存在的療效差、副作用大以及安全性不保障等方面的缺點，為乳腺癌干細胞的基因治療提供新的實驗和理論依據(jù)，使廣大的乳腺癌患者尤其三陰耐藥乳腺癌因本項目而受益。本項研究具有潛在的巨大社會效益和經(jīng)濟效益。
　　 方法：
　　 1.Galectin-3在乳腺癌組織

19、中的表達及與Survivin、Ki-67的相關(guān)性
　　 1.1采用免疫組化SP法檢測120例乳腺癌組織，120例癌旁乳腺正常組織中Galectin-3、Survivin、Ki-67的表達。
　　 1.2比較Galectin-3、Survivin和Ki-67表達水平與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系。
　　 1.3 Spearman秩檢驗分析乳腺癌中Galectin-3和Survivin表達的相關(guān)性。
　　 1.4

20、 Spearman秩檢驗分析乳腺癌中Galectin-3和Ki-67表達的相關(guān)性。
　　 1.5 Spearman秩檢驗分析乳腺癌中Survivin和Ki-67表達的相關(guān)性。
　　 2.RNA干擾技術(shù)抑制Galectin-3表達對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖、凋亡和侵襲的影響
　　 2.1設(shè)計并化學合成Galectin-3小干擾片段并瞬時轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞系MDA-MB-231（為Galectin-3si

21、RNA組）。
　　 2.2以未轉(zhuǎn)染細胞為空白對照，以轉(zhuǎn)染無關(guān)siRNA為陰性對照，熒光倒置顯微鏡觀察感染效率，實時定量PCR檢測干擾結(jié)果。
　　 2.3 XTT方法觀察干擾后24，48，72和96h各組細胞增殖吸光度（A值），流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。
　　 2.4劃痕實驗和Transwell實驗比較不同組間細胞遷移和侵襲情況。
　　 3.IL-24-TRAIL基因載體的構(gòu)建及其對乳腺癌干細胞遷移和

22、凋亡的影響
　　 3.1以人胎盤組織總RNA為模板，采用RT-PCR二步法，擴增TRAIL的cDNA序列，將其克隆入pIRES載體。
　　 3.2擴增IL-24的cDNA序列，將其克隆入pIRES-TRAIL載體，構(gòu)建其真核瞬時表達載體pIRES-IL-24-TRAIL。
　　 3.3以Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染技術(shù)，將TRAIL、IL-24基因?qū)肴橄侔└杉毎鸐CF-7和MDA-MB-231。

23、>　　 3.4流式細胞儀檢測兩組細胞凋亡情況。
　　 3.5劃痕實驗比較不同組間細胞遷移情況。
　　 4.統(tǒng)計分析
　　 均采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件包分析和處理實驗結(jié)果數(shù)據(jù)，采用Chi-squaretest分析Galectin-3、Survivin、Ki-67蛋白表達與臨床病理資料（包括病人年齡、性別、腫瘤分級及TNM分期）之間的聯(lián)系。用Pearson列聯(lián)系數(shù)(C)和配對資料的卡方檢驗，進一步分析Gale

24、ctin-3、Survivin、Ki-67蛋白三者的相關(guān)性。細胞實驗數(shù)據(jù)均以(x)±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA):進行方差齊性檢驗，各組間反應(yīng)變量為方差齊性，則組間比較采用LSD法，若方差不齊采用近似方差分析Brown-Forsythe法進行校正，采用析因分析明確分組與時間點之間是否存在交互作用，以P＜0.05確定為差異具有顯著性，雙側(cè)檢驗。
　　 結(jié)果：
　　 1.Galectin-

25、3在乳腺癌組織中的表達及與Survivin、Ki-67的相關(guān)性
　　 1.1120例乳腺癌組織中Galectin-3和Ki-67在乳腺癌組織中表達高于癌旁正常組織(75.00％VS8.33％, x2=109.70, P＜0.001;62.50％VS6.67％, x2=82.68,P＜0.001），并與乳腺癌病理分級、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(x2=8.571，P=0.014;x2=4.444，P=0.035; x2=6.834，P=0

26、.033;x2=18.809，P＜0.001)，差異具有統(tǒng)計學意義，但與年齡、腫瘤大小無顯著相關(guān)(x2=0.012，P=0.913; x2=0.212，P=0.645; x2=0.192, P=0.661; x2=0.042,P=0.837)。
　　 1.2 Survivin蛋白的陽性表達率為70.83％，顯著高于癌旁正常組織5.00％(x2=110.50，P＜0.001)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(x2=9.076，P＜0.001)

27、，差異具有統(tǒng)計學意義，但與年齡、腫瘤大小，腫瘤組織分級均無顯著相關(guān)性(X2=0.003，P=0.959;x2=0.156,P=0.925; x2=0.048, P=0.827)。
　　 1.3乳腺癌組織中Galectin-3、Survivin和Ki-67三者間兩兩呈正相關(guān)(x2=24.27, C=0.41,P＜0.001; x2=27.23, C=0.43,P＜0.001; x2=26.18, C=0.42,P＜0.001)。<

28、br>　　 2.RNA干擾技術(shù)抑制Galectin-3表達對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖、凋亡和侵襲的影響
　　 2.1轉(zhuǎn)染后24 h，熒光倒置顯微鏡顯示轉(zhuǎn)染效率為80.60±5.62％，實時定量PCR提示Galectin-3siRNA轉(zhuǎn)染后相應(yīng)Galectin-3的表達顯著下降(0.077±0.003VS0.072±0.004VS0.016±0.001,F=479.7,P＜0.001)。
　　 2.2干擾

29、后24，48，72和96 h空白組和陰性對照組細胞繼續(xù)生長，Galectin-3siRNA組細胞生長抑制，數(shù)量逐漸減少（1.61±0.05、1.86±0.04、2.04±0.26、2.80±0.07VS1.60±0.07、1.77±0.10、2.01±0.37、2.49±0.15VS1.18±0.04、0.97±0.02、0.68±0.15、0.46±0.12)，干擾時間和實驗分組之間存在交互效應(yīng)(F=39.18，P＜0.001)。

30、r>　　 2.3流式細胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，Galectin-3siRNA組比空白對照組、陰性對照組凋亡率高(36.99％±0.27％VS2.22％±0.03％VS3.84％±0.05％)，差異有統(tǒng)計學意義(F=44058.82, P＜0.001)。
　　 2.4 Transwell侵襲實驗顯示轉(zhuǎn)染Galectin-3siRNA的乳腺癌細胞浸潤穿過Matrigel膜的細胞數(shù)比空白對照組和陰性對照組的細胞數(shù)（154.70±24.01VS

31、465.00±31.76VS322.30±23.18），差異有統(tǒng)計學意義(F=102.30，P＜0.001)。細胞劃痕實驗顯示Galectin-3siRNA組細胞遷移能力顯著低于空白對照組和陰性對照組（愈合率:48.39％±1.63％VS92.62％±2.88％VS88.49±2.25％,F=308.80,P＜0.001）。
　　 3.IL-24-TRAIL基因載體的構(gòu)建及其對乳腺癌干細胞遷移和凋亡的影響
　　 3.1克

32、隆到TRAIL、IL-24基因的cDNA序列，成功構(gòu)建其真核表達載體。
　　 3.2流式細胞儀發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-231細胞組結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組比空白對照組、陰性對照組凋亡壞死率高，差異有統(tǒng)計學意義(27.91％±1.05％，68.81％±5.53％VS10.54％±1.13％,9.52％±0.95％, F=272.90, P＜0.001)。 MCF-7細胞組結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組比空白對照組、陰性對照組凋亡壞死率高，差異有統(tǒng)計學意義（13

33、.69％±1.09％，58.71％±3.03％VS3.31％±0.22％，4.32％±0.47％，F(xiàn)=774.60，P＜0.001）。
　　 3.3分別對MDA-MB-231、MCF-7細胞進行劃痕實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)48 h后空白對照組和陰性對照組細胞運動遷移基本上覆蓋了大部分劃痕區(qū)（愈合率:91.77％±2.25％、87.54％±2.93％;93.34％±2.33％、89.54％±2.15％），而轉(zhuǎn)染組劃痕區(qū)依然顯著存在（愈合率:

34、37.47％±1.53％、30.21％±1.29％;39.8％±1.22％、31.85％±1.33％），表明細胞遷移能力下調(diào)(F=716.40，P＜0.001; F=848.10，P＜0.001)。
　　 結(jié)論：
　　 1.Galectin-3在乳腺癌組織中的表達及與Survivin、Ki-67的相關(guān)性
　　 Galectin-3、Survivin、Ki-67蛋白相互協(xié)同作用，通過抑制細胞凋亡，對乳腺癌發(fā)生和發(fā)展

35、起重要作用。
　　 2.RNA干擾技術(shù)抑制Galectin-3表達對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖、凋亡和侵襲的影響
　　 RNA干擾能抑制Galectin-3的表達以及MDA-MB-231細胞的增殖，并誘導細胞凋亡、降低其遷移侵襲能力。
　　 3.IL-24-TRAIL基因載體的構(gòu)建及其對乳腺癌干細胞遷移和凋亡的影響
　　 pIRES-IL-24-TRAIL構(gòu)建成功，并能誘導乳腺癌干細胞凋亡、

36、降低其遷移能力。
　　 創(chuàng)新之處
　　 1.乳腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及多個基因及各種調(diào)控因子的相互作用，是一個復(fù)雜的過程，Galectin-3、Survivin及Ki-67與乳腺癌的預(yù)后有顯著的相關(guān)性，可作為乳腺癌的預(yù)后指標，有待進一步研究探討三者具體的作用機制，為乳腺癌靶向治療提供了新的靶點。
　　 2.乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移是一個多因素、多步驟的進展過程，本項目從臨床、分子細胞學兩方面研究乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制，用RNA干

37、擾技術(shù)、免疫組化、RT-PCR、凋亡分析等技術(shù)進行研究，很有深度和廣度，目前國內(nèi)外有許多關(guān)于Galectin-3siRNA在呼吸、消化道等腫瘤治療上的研究，但少有關(guān)于三陰性乳腺癌的研究，本課題具有重大應(yīng)用價值和理論意義。
　　 3.雖然國際上已經(jīng)開始利用重組IL-24或TRAIL治療某些惡性腫瘤的實驗研究，但是尚未有聯(lián)合在乳腺癌方面運用的報道，本研究項目擬采用pIRES作為IL-24和TRAIL基因的載體，構(gòu)建pIRES-IL-