細絲蛋白A調(diào)控EGFR活化對肺腺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、肺癌是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，每年都有超過一百萬新發(fā)病例，其中約80％為非小細胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)。作為一種全身性疾病，肺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復發(fā)是由多條信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)，多因素參與的復雜過程。對腫瘤信號轉(zhuǎn)導通路的研究有助于闡明NSCLC的發(fā)病機制，為NSCLC的治療提供新的分子靶點。
　　 表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorrecep

2、tor，EGFR)為具有酪氨酸激酶活性的受體，分子量170kDa(1186氨基酸)，位于染色體7q12。EGFR家族有4個結構相似的受體分子:ErbB1(EGFR)、ErbB2（HER2）、ErbB3(HER3)、ErbB4（HER4）。EGFR為跨膜受體，有細胞外的配體結合區(qū)域，跨膜區(qū)和細胞內(nèi)的酪氨酸激酶活性區(qū)域組成。EGFR具有酪氨酸激酶活性，通過與配體結合，EGFR形成同源或異源二聚體而活化，進一步激活受體介導的多條信號轉(zhuǎn)導通路，

3、如Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K/Akt通路等，發(fā)揮促進腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成作用。EGFR由表皮生長因子（epidermalgrowthfactor，EGF）激活，調(diào)節(jié)正常和惡性上皮細胞的生長、分化和存活。EGFR在40-80％的NSCLC過表達中表達，而且其表達與預后不佳相關。因此，EGFR和它的家族成員已成為靶向治療的主要候選靶分子。NSCLC患者EGFR過表達，往往提示TNM分期晚，出現(xiàn)淋巴結轉(zhuǎn)移的可能性大

4、，進展快，預后不良。
　　 細絲蛋白A(filaminA，F(xiàn)LNa)是非肌性肌動蛋白結合蛋白，基因結構高度保守，表達廣泛，對哺乳動物的生長發(fā)育具有重要的作用。FLNa蛋白包括一個肌動蛋白結合結構域和24個串聯(lián)的重復序列，研究發(fā)現(xiàn)FLNa重復序列所形成的類似免疫球蛋白樣結構的多重β-折疊片層結構，為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用提供了界面。FLNa涉及多條與腫瘤形成有關的信號轉(zhuǎn)導通路，如MAPK/ERK、PI3K/Akt、TGF-β等，影

5、響腫瘤細胞的增殖、粘附、遷移和侵襲等行為。許多研究表明，F(xiàn)LNa在人類上皮腫瘤例如肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、結直腸癌等多種腫瘤表達增多。Zhu認為FLNa對于人黑色素瘤細胞EGFR的活化具有調(diào)控作用。FLNa是否調(diào)控肺腺癌細胞EGFR的活化目前尚無報道。
　　 本研究擬通過:(1)Westernblot檢測不同肺腺癌細胞中FLNa、EGFR蛋白的表達情況;(2)采用MTT法檢測5種不同肺腺癌細胞的增殖能力;(3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術

6、沉默F(xiàn)LNa的表達，構建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞，采用MTT法、劃痕修復實驗（Woundhealingassay）及Transwell法(Transwellcellinvasionassay)檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的增殖、遷移和侵襲能力;(4)利用westernblot、免疫共沉淀法(Immunoprecipitation，IP)檢測EGFR磷酸化水平及其下游信號通路分子的變化。旨在從細胞、分子水平上分析FLNa對肺腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，探討F

7、LNa調(diào)控EGFR磷酸化及其下游信號分子的作用機制，為更有效治療肺腺癌提供新靶點。
　　 目的:觀察不同肺腺癌細胞FLNa和EGFR的表達情況，分析FLNa、EGFR與肺腺癌細胞增殖的關系;將pSIF1-FLNasiRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GLC-82細胞，降低FLNa的表達水平，觀察FLNa對GLC-82細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響;探討FLNa調(diào)控EGFR磷酸化及其下游信號分子的作用機制。
　　 方法:
　　 1、W

8、esternblot檢測不同肺腺癌細胞中FLNa、EGFR蛋白的表達情況;
　　 2、采用MTT法檢測不同肺腺癌細胞的增殖能力;
　　 3、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術沉默F(xiàn)LNa的表達，構建穩(wěn)定低表達FLNa細胞，采用MTT法、Woundhealingassay及Transwell法，檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的增殖、遷移和侵襲能力;
　　 4、Westernblot、IP檢測EGFR酪氨酸磷酸化水平及其下游信號通路分子的變化。

9、　　 結果:
　　 1、不同肺腺癌細胞的蛋白表達情況和增殖能力
　　 1.1、不同肺腺癌細胞的蛋白表達情況
　　 應用ImageJ軟件對蛋白條帶進行掃描，SPSS13.0進行分析，不同肺腺癌細胞FLNa、EGFR的表達水平分別為:GLC-82(1.02±0.18，0.86±0.01)，H1975(1.15±0.05,0.92±0.01),A549(0.64±0.03,0.95±0.01),H1650(0.22±

10、0.01,0.69±0.01)和H1299(0.79±0.02,1.13±0.01)。H1650細胞FLNa和EGFR的表達水平均低于其余各種細胞，均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 1.2、不同肺腺癌細胞的增殖情況
　　 利用MTT比色分析法測定各孔的OD值，分別于EGF刺激20h、44h后檢測各孔的OD值，EGF刺激20h、44h后各種細胞OD值分別為:GLC-82(0.42±0.01,0.64±0.09),H

11、1975(0.40±0.03,0.54±0.06),A549(0.30±0.02,0.65±0.06)，H1650(0.12±0.01，0.20±0.03)和口H1299(0.40±0.02，0.91±0.00)，低表達FLNa的H1650細胞的OD值各時間點均明顯低于其余各種細胞，均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 2、實時定量PCR、westernblot驗證沉默F(xiàn)LNa效果
　　 2.1、實時定量PCR檢測穩(wěn)定

12、轉(zhuǎn)染細胞的FLNamRNA水平
　　 利用實時定量PCR檢測GLC-82穩(wěn)定細胞FLNamRNA的水平，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FLNasiRNA的GLC-82細胞FLNamRNA的相對定量值（0.38±0.23）明顯低于對照組細胞(1.00)，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　 2.2、Westernblot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞FLNa的表達水平
　　 Westernblot檢測GLC-82穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞FLNa的蛋白水平，穩(wěn)定轉(zhuǎn)

13、染FLNasiRNA的GLC-82細胞FLNa的相對表達量（0.39±0.00），明顯低于對照細胞（0.66±0.00），有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3、GLC-82穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的增殖、遷移和侵襲情況
　　 3.1、GLC-82穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的增殖情況
　　 將GLC-82穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞接種于96孔板，MTT法檢測各孔的OD值進行統(tǒng)計分析，分別經(jīng)0nM、4nM、20nMEGF刺激后各孔的OD值，GLC-82

14、/FLNasiRNA組(0.48±0.02，0.64±0.03，0.70±0.04)各濃度均明顯低于對照組(0.55±0.04，0.73±0.05，0.81±0.04)，均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3.2、GLC-82穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的遷移情況
　　 利用相應軟件測量劃痕寬度，計算細胞遷移率:細胞遷移率=（劃痕初始寬度．劃痕目前寬度）/2/劃痕初始寬度×100％。無EGF刺激時，降低FLNa表達的GLC-82細胞

15、分別于8h、16h、24h和32h的遷移率（8.11±2.45％，15.78±0.84％，16.23±2.27％，19.89±2.91％）各時間點均低于對照組(15.47±0.74％，21.38±1.66％，25.00±2.17％，30.43±0.11％)，均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);GLC-82/FLNasiRNA細胞給予20nMEGF刺激后，各時間點的遷移率明顯高于無EGF刺激組;GLC-82/Control細胞給予20nME

16、GF刺激后，從24h開始細胞遷移率明顯高于無EGF刺激組，均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3.3、GLC-82穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的侵襲情況
　　 采用Transwell法檢測細胞的侵襲能力，GLC-82/FLNasiRNA組穿膜細胞數(shù)(192±70)明顯低于對照組(368±73)，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4、FLNa作用機制的探討
　　 4.1、沉默F(xiàn)LNa表達對GLC-82細胞EGFR活

17、化的影響
　　 培養(yǎng)GLC-82穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞，Westernblot檢測EGF刺激0min、5min、10min、30min后蛋白的表達情況。統(tǒng)計結果顯示，F(xiàn)LNasiRNA組各時間點FLNa的表達量（0.10±0.00，0.28±0.00，0.25±0.00，0.18±0.00）均明顯低于對照組（0.52±0.00，0.72±0.00，0.71±0.00，0.73±0.04），均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);FLNasiRNA

18、組磷酸化EGFR分別于EGF刺激5min、10min、30min后的表達水平（0.74±0.00，0.53±0.00，0.23±0.00）均明顯低于對照組（0.81±0.00，0.68±0.00，0.60±0.02），均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）;FLNasiRNA組磷酸化ERK分別于EGF刺激5min、10min、30min后的表達水平（0.32±0.00，0.40±0.00，0.31±0.00）均明顯低于對照組（0.38±0.01

19、，0.63±0.00，0.98±0.01），均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 4.2、IP證實FLNa對EGFR活化的影響
　　 經(jīng)抗EGFR抗體免疫沉淀后，用抗酪氨酸磷酸化的抗體4G10進行印跡，觀察EGFR磷酸化水平:EGF刺激5min后，F(xiàn)LNasiRNA組EGFR相對磷酸化水平（0.95±0.03）明顯低于對照組（1.16±0.01），有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　 結論:
　　 1、