鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白及其磷酸化對(duì)乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、乳腺癌是全球女性癌變?cè)\斷率最高的癌癥之一，由于其高轉(zhuǎn)移活性以及轉(zhuǎn)移后高達(dá)90％的死亡率而備受人們關(guān)注。無序生長和高運(yùn)動(dòng)活性是轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的重要特征，這兩個(gè)過程都涉及到細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架在各種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)下的解聚與重排。鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白(Caldesmon，CaD)是存在于幾乎所有脊椎動(dòng)物細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，有由同一基因衍生的兩種亞型：平滑肌型(h-caldesmon，h-CaD)和普遍存在的非肌型輕鏈CaD(1-cald

2、esmon，1-CaD)。
　　 體外研究表明，1-CaD通過與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白纖維結(jié)構(gòu)，抑制其解聚。因此，人們都普遍認(rèn)為1-CaD在細(xì)胞內(nèi)的基本功能為減弱細(xì)胞骨架調(diào)整，抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)活性。事實(shí)上，在眾多非轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中，1-CaD的表達(dá)量顯著下調(diào)，但在一些高遷移活性的轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中，1-CaD不僅表達(dá)量明顯增加，胞內(nèi)磷酸化程度也大幅度提高，抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)活性顯然不能完全概括1-CaD在轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中的功能。為揭示1-Ca

3、D對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)活性的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制，并為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)乳腺癌本質(zhì)提供了新的思路，本研究以人源轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞MD MB-231和非轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞MCF-7作為實(shí)驗(yàn)載體，首先，通過構(gòu)建體外肌動(dòng)蛋白聚合陣列驗(yàn)證了1-CaD及其磷酸化對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合過程的影響；其次，通過基因沉默和外源基因高表達(dá)相結(jié)合的方法，探索1-CaD及其磷酸化對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)活性的可能調(diào)節(jié)機(jī)制；最后，我們將模擬1-CaD磷酸化位點(diǎn)封閉的合成多肽導(dǎo)入

4、MD MB-231細(xì)胞內(nèi)并通過裸鼠腫瘤形成模型，進(jìn)一步檢測(cè)1-CaD及其磷酸化對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)活性以及在體腫瘤形成能力的影響。我們的主要研究?jī)?nèi)容包括：
　　 ①體外蛋白層次上，利用熒光標(biāo)記的G-actin，在F-actin緩沖體系中，不同時(shí)間位點(diǎn)分別加入1-CaD的C-端功能片段H32K及其磷酸化形式，檢測(cè)G-actin聚合形成F-actin的動(dòng)力學(xué)過程。結(jié)果顯示，H32K能夠迅速與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，并對(duì)肌動(dòng)蛋白的聚合過程

5、有雙重調(diào)節(jié)作用：在肌動(dòng)蛋白聚合初期，H32K將抑制成熟肌動(dòng)蛋白纖維的形成；在肌動(dòng)蛋白聚合過程中，H32K將促進(jìn)成熟肌動(dòng)蛋白纖維的形成。磷酸化H32K失去了對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合初期的抑制作用，對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合無顯著影響。
　　 ②細(xì)胞層次上，western-blotting檢測(cè)MDA MB-231、MCF-7以及正常人源上皮細(xì)胞HMEC的胞內(nèi)1-CaD表達(dá)量及其磷酸化程度。結(jié)果顯示，1-CaD在MDAMB-231細(xì)胞中獲得了顯著高表達(dá)，其

6、表達(dá)水平與HMEC細(xì)胞相當(dāng)，而MCF-7的1-CaD表達(dá)量顯著低于MDA MB-231細(xì)胞。除此之外，MDA MB-231胞內(nèi)1-CaD磷酸化水平顯著高于HMEC細(xì)胞。1-CaD在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中的高表達(dá)以及顯著高于正常細(xì)胞的磷酸化水平，可能是轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞高侵襲表象的一個(gè)重要因素。
　　 ③利用siRNA慢病毒載體感染MDA MB-231細(xì)胞，抑制胞內(nèi)1-CaD表達(dá)，首先，通過western-blotting，檢測(cè)1-Ca

7、D基因沉默的效率；其次，通過rhodaminephalloidin染色細(xì)胞骨架，考察1-CaD表達(dá)沉默對(duì)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響，再次，通過Transwell檢測(cè)細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力，最后通過Traction force、細(xì)胞粘附陣列進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞遷移過程中的細(xì)胞基底牽張力與基底粘附能力。結(jié)果顯示，1-CaD表達(dá)沉默將導(dǎo)致細(xì)胞失去完整的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)應(yīng)力纖維結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)活性顯著下降，細(xì)胞遷移過程中的細(xì)胞基底牽張力與粘附能力亦顯著

8、下調(diào)。
　　 ④利用外源野生型wtCaD以及模擬PAK和ERK磷酸化位點(diǎn)封閉的1-CaD突變株A1234和模擬PAK和ERK位點(diǎn)完全磷酸化的突變株D1234作為“分子探針”來干擾或阻斷胞內(nèi)1-CaD磷酸化進(jìn)程。檢測(cè)外源1-CaD質(zhì)粒的表達(dá)效率，考察高表達(dá)外源1-CaD細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)，檢測(cè)細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)活性以及細(xì)胞基底牽張力與粘附能力。結(jié)果顯示，wtCaD與A1234轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，細(xì)胞骨架顯著增強(qiáng)，細(xì)胞基底牽張力與粘附能力明顯上調(diào)，

9、但細(xì)胞整體遷移運(yùn)動(dòng)能力明顯受到抑制；D1234對(duì)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)無顯著影響，但明顯抑制了轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力，對(duì)非轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的影響不顯著。
　　 ⑤合成模擬1-CaD在PAK與ERK磷酸化位點(diǎn)封閉的多肽，并導(dǎo)入MDA MB-231細(xì)胞內(nèi)，檢測(cè)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)變化，考察細(xì)胞的增殖和遷移運(yùn)動(dòng)活性，通過裸鼠腫瘤形成模型，檢測(cè)多肽導(dǎo)入后的MDA MB-231在體腫瘤形成能力。結(jié)果顯示，合成多肽能夠顯著抑制MDA MB-231細(xì)胞

10、的增殖和運(yùn)動(dòng)活性以及在體的腫瘤形成能力。
　　 綜合以上結(jié)論我們推測(cè)，1-CaD是轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的重要組成部分和調(diào)節(jié)因子，并能通過介導(dǎo)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)調(diào)整影響乳腺癌細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)活性。1-CaD在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞內(nèi)的高表達(dá)和高效的磷酸化-去磷酸化循環(huán)可能是維持轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞高遷移活性的關(guān)鍵因素，抑制1-CaD在胞內(nèi)的表達(dá)或干擾其胞內(nèi)磷酸化循環(huán)都將顯著抑制轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)活性。模擬非磷酸化1-CaD的合成多肽對(duì)轉(zhuǎn)移