PTPN18對HER2蛋白的磷酸化水平和泛素化水平的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、細胞對于生長因子的不正常反應會造成細胞的異常生長，這在人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起關鍵作用。HER2目前引起了廣泛的關注，因為其高表達預示著乳腺癌，卵巢癌，胃癌和其它癌癥等的預后不良。HER2通常被看成是一個孤兒受體，當受到表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）刺激時，HER2作為EGFR家族的一個成員，與EGFR家族的其它成員形成同源或異源二聚體，進而激活下游的細胞信號通路，影響細胞功能。HER2的C末端酪

2、氨酸殘基的磷酸化是由蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases，PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases，PTPs）兩種酶精確協(xié)同控制的。其中的蛋白酪氨酸磷酸酶在細胞信號通路中作為一個重要的角色，調(diào)控細胞的功能。在不同的刺激條件下，蛋白酪氨酸磷酸酶的調(diào)節(jié)影響了細胞生長和增殖，細胞周期，細胞骨架等細胞功能。最近的研究發(fā)現(xiàn)PTP-MEG2，PTPN12，PTPN13和PT

3、PN18，這些蛋白酪氨酸磷酸酶在特定的細胞環(huán)境中參與HER2相關的信號通路;然而，由這些磷酸酶調(diào)控HER2的酪氨酸磷酸化的機制從未詳細探討。其中，PTPN18，也叫BDP1，是第一個被發(fā)現(xiàn)的針對HER2蛋白的酪氨酸磷酸酶;同時PTPN18的N端是蛋白酪氨酸磷酸酶催化結構區(qū)域，C端調(diào)控區(qū)域富集脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)，因此屬于酪氨酸磷酸酶PEST家族。有趣的是，PTPN18只對HER2進行去磷酸化的作用，而不

4、對EGFR或IGF1R的磷酸化的酪氨酸進行去磷酸化。以前的研究發(fā)現(xiàn)PTPN18可以調(diào)控HER2的磷酸化水平，然而這其中如何調(diào)控HER2信號通路的分子機制還不清楚。本論文研究表明PTPN18催化結構域水解底物具有嚴格的底物特異性，并且發(fā)現(xiàn)其C端調(diào)控結構域介導HER2泛素化的新功能。
　　研究方法：
　　1)體外蛋白表達純化
　　通過大腸桿菌-BL21原核表達系統(tǒng)，表達帶有GST和HIS標簽的不同長度的PTPN18蛋白和部

5、分蛋白酪氨酸磷酸酶家族的蛋白;通過親和層析和離子交換的方法獲得純度高達95％以上的目的蛋白。
　　2)體外酶活測定
　　以小分子化合物pNPP和帶有磷酸化的酪氨酸的短肽為底物，檢測PTPN18的催化結構域?qū)@兩類底物的催化活力。利用點終止法通過酶標儀進行讀數(shù)，獲得酶活常數(shù)Kcat和Km。同時體外檢測PTPN18催化結構域?qū)毎麅?nèi)生理底物—HER2的磷酸酶活力。
　　3)晶體生長及晶體結構解析
　　將純化的PTPN

6、18的催化結構域陷阱突變蛋白分別與含有HER2的pY1112，pY1196，pY1248這3個酪氨酸位點磷酸化的磷酸多肽混合，懸滴法共結晶，25℃靜置3天后收集單晶，并通過X-射線衍射獲得衍射數(shù)據(jù)，解析PTPN18的催化結構域蛋白與HER2磷酸短肽復合物的晶體結構。
　　4)免疫共沉淀(CO-IP)技術
　　在哺乳細胞HepG2細胞和MCF-7細胞中，過表達或干擾PTPN18以及β-TRCP后，通過免疫共沉淀的方法檢測PTP

7、N18與其它蛋白的相互作用以及PTPN18對HER2蛋白泛素化的影響。
　　5) GST-pulldown實驗
　　將體外純化的帶GST標簽的不同截短的PTPN18蛋白與細胞內(nèi)HER2蛋白進行共孵育，檢測不同截短的PTPN18蛋白對HER2蛋白的結合能力。
　　6) MTT方法
　　在HepG2細胞內(nèi)過表達PTPN18不同的突變質(zhì)粒或干擾PTPN18，通過加入MTT觀察24-72小時的細胞增殖狀態(tài)?；罴毎€粒體中

8、的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死的細胞沒有這種功能。在酶聯(lián)免疫檢測儀(OD570 nm)測定其光吸收值，間接反映活細胞的數(shù)量，從而反映PTPN18對細胞增殖的影響。
　　7) Transwell方法
　　在HepG2細胞內(nèi)過表達PTPN18不同的突變質(zhì)粒，加EGF刺激后，利用結晶紫染色，檢測不同時間點內(nèi)各個突變體對該細胞的侵襲的能力。
　　8)免疫熒光

9、染色
　　在HepG2細胞內(nèi)過表達PTPN18的野生型和D197A突變體，用單克隆抗體RPN12(蛋白酶體途徑的標記物)和Lamp1（溶酶體途徑的標記物）檢測PTPN18對HER2蛋白的分布、降解的調(diào)控作用。
　　9) Western Blot
　　在細胞系中對PTPN18進行干擾后，加EGF刺激檢測在不同時間點HER2和EGFR的C末端不同的酪氨酸位點的磷酸化水平。
　　在細胞系中過表達PTPN18野生型及不同

10、的突變型，加EGF刺激后檢測PTPN18對HER2的C末端不同的酪氨酸位點的磷酸化水平，以及對HER2相關信號通路（增殖，遷移和HER2蛋白降解）的影響。
　　在細胞系中過表達HER2的C末端質(zhì)粒，加EGF刺激后IP純化HER2C末端蛋白，與純化的PTPN18的催化結構域蛋白進行體外酶活分析，利用Western檢測PTPN18對HER2的C末端不同的酪氨酸位點的磷酸化水平。
　　在細胞系過表達PTPN18野生型及不同的截短及

11、失活突變后，檢測PTPN18對HER2蛋白的結合能力。
　　在多種乳腺癌細胞系或人乳腺癌組織樣品中，檢測PTPN18蛋白與HER2蛋白的表達量以及相關性。
　　10)統(tǒng)計分析
　　所有實驗均重復3次以上，應用Image J分析軟件對Western Blot進行蛋白定量分析;應用Graphad Prism5統(tǒng)計軟件進行酶活數(shù)據(jù)的分析;所有數(shù)據(jù)均采用±標準誤表示，采用單因素方差分析和t檢驗對相關數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以P＜0.

12、01用**或＃＃進行標記，以P＜0.05用*或＃進行標記。
　　結果：
　　我們在蛋白分子水平和細胞水平研究并闡明了PTPN18的N端催化結構域和C端調(diào)控結構域?qū)ζ涞孜颒ER2的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，PTPN18通過N端磷酸酶催化結構域?qū)ER2的去磷酸化以及C端PEST結構域?qū)ER2的泛素化進行精確調(diào)控，從而調(diào)控HER2介導的細胞內(nèi)信號通路。具體結果如下:
　　1)我們對PTPN18和HER2進行體外酶活性的測定和晶

13、體結構的解析闡明了PTPN18對HER2的C末端不同的磷酸化位點具有選擇性。我們解析了PTPN18催化結構域陷阱突變與磷酸多肽的復合物晶體結構（PTPN18與含有HER2的pY1112，pY1196，pY1248磷酸化位點的3個磷酸多肽的晶體復合物），并發(fā)現(xiàn)PTPN18中的催化區(qū)結構域?qū)ER2的C末端的磷酸化的酪氨酸去磷酸化的選擇特異性及結構基礎。PTPN18與HER2的pY1112，pY1196，pY1248這3個磷酸多肽的晶體結構

14、復合物同時顯示了以下兩種特殊的結構特征:(1) HER2短肽的pY+1位氨基酸殘基與PTPN18具有疏水相互作用，可以選擇性調(diào)節(jié)兩者之間的作用。(2)PTPN18的第198位的精氨酸側鏈的可塑性，其側鏈對兩種短肽底物的識別具有重要意義。
　　2)我們研究發(fā)現(xiàn)PTPN18對HER2的不同磷酸化位點的特異性作用抑制了HER2介導的細胞增殖和細胞遷移。在細胞系中，過表達PTPN18野生型及不同突變型，發(fā)現(xiàn)PTPN18特異性去磷酸化HER

15、2的C端第1196位和1248位酪氨酸的關鍵氨基酸(hot spot);闡明了PTPN18降低HER2的C末端的第1196位和第1248位的酪氨酸磷酸化水平，從而對HER2介導的細胞增殖和侵襲具有負向調(diào)控作用的分子機制。
　　3)我們研究發(fā)現(xiàn)PTPN18的C端PEST調(diào)控結構域介導HER2泛素化的新功能。雖然PTPN18的催化結構域通過去磷酸化HER2的C末端第1112位酪氨酸的磷酸化，而減少與E3泛素連接酶c-Cbl的結合，從而

16、延遲了HER2蛋白的溶酶體降解途徑，但是PTPN18的PEST結構域可以促進泛素蛋白K48介導的HER2蛋白的泛素化進而引起蛋白酶體的降級途徑。其中我們發(fā)現(xiàn)，PTPN18的C端第419-423位氨基酸序列中S419/S423磷酸化后與β-Trcp結合，通過“AKT-PTPN18/β-Trcp-HER2”泛素化途徑對HER2蛋白有降快速解作用。PTPN18切換HER2的泛素化和降解的路線，這既需要PTPN18 N端的催化結構域和C端的PE