七氟醚麻醉對腦內(nèi)ERK1-2、CREB和PKCγ磷酸化水平的影響.pdf

1、全麻問世并廣泛應(yīng)用于臨床已有160 余年。然而，全麻藥物是如何引起機(jī)體意識喪失、遺忘、制動等全麻效應(yīng)的？全麻藥物的作用靶點(diǎn)是什么？至今仍是未解之謎，對全麻藥物本質(zhì)及作用機(jī)理認(rèn)識的局限，極大制約了全身麻醉安全、可控的臨床應(yīng)用及新型麻醉藥物的研發(fā)。 應(yīng)該肯定的一點(diǎn)是：全麻藥物是作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)而產(chǎn)生意識喪失、遺忘、制動等麻醉效應(yīng)的。一般認(rèn)為，全麻藥物是作用于前額皮層、頂皮層、海馬等區(qū)域產(chǎn)生鎮(zhèn)靜和遺忘作用，而脊髓和低位腦干在臨床全麻

2、藥物的制動效應(yīng)中起了主導(dǎo)作用?？梢?，全麻藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用是多方位、多靶點(diǎn)的，單一的膜脂溶性、離子通道、受體及基因等學(xué)說無法完全解釋全麻(尤其是吸入麻醉)的復(fù)雜效應(yīng)。 既往全麻機(jī)制研究中已發(fā)現(xiàn)大量受體、分子與全麻效應(yīng)可能相關(guān)，但很難將這些分散的結(jié)果有機(jī)地聯(lián)系起來。細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)具有變化迅速，能將大量信號有機(jī)串聯(lián)和整合的特點(diǎn)。 本研究中我們擬以目前臨床常用的吸入性麻醉劑七氟醚為例，從麻醉時腦內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子活化水平

3、的變化入手，為探討吸入麻醉的中樞機(jī)制尋找突破口。 目的 觀察七氟醚麻醉－蘇醒過程中腦內(nèi)ERK1/2、CREB 和PKCγ磷酸化水平的變化，以了解這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在全麻機(jī)理中的可能作用，為探索吸入麻醉藥的中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用靶位和相關(guān)信號通路提供資料。 方法 第一部分 1. 小鼠七氟醚麻醉－蘇醒過程中腦內(nèi)磷酸化ERK1/2 的表達(dá)變化BALB/c 小鼠60 只，平均分為5 組：正常對照組(Con)、七氟

4、醚麻醉5min組(Sevo-1)、麻醉1h 組(Sevo-2)、麻醉1h 停藥2min 組(E-1)和麻醉1h 停藥1h組(E-2)。各組動物在相應(yīng)時間點(diǎn)脫臼處死，取腦制樣或經(jīng)灌注固定后取腦切片，行Western blotting 或免疫組織化學(xué)染色，觀察七氟醚麻醉－蘇醒過程不同腦區(qū)磷酸化ERK1/2 (pERK1/2)水平的變化。 2. 七氟醚麻醉下小鼠的血?dú)怆娊赓|(zhì)狀況雄性BALB/c 小鼠12 只，隨機(jī)分為2 組：對照組(C

5、on)和七氟醚麻醉1h組(Sevo-1h)，相應(yīng)時間點(diǎn)開胸心臟采集動脈血，了解麻醉過程中的血?dú)饧半娊赓|(zhì)情況。 3. MEK1/2 拮抗劑SL327 對七氟醚麻醉行為的影響雄性BALB/c小鼠18 只，隨機(jī)分為3 組：Con組；DMSO組：麻醉前1 小時腹腔注射25％DMSO，6 ml·kg-1；SL327 組：麻醉前1 小時腹腔注射溶解于25％DMSO的SL327，30 mg·kg-1。各組小鼠以4％七氟醚誘導(dǎo)，記錄翻正反射消失

6、時間，然后以1MAC七氟醚維持麻醉30min后，停止麻醉，高流量氧氣洗脫，觀察夾尾反射恢復(fù)時間。待夾尾反射恢復(fù)后，動物斷頭，取腦制樣，Western blotting檢測腦內(nèi)pERK1/2 表達(dá)水平。 第二部分 小鼠七氟醚麻醉－蘇醒過程不同腦區(qū)磷酸化CREB 的表達(dá)變化雄性BALB/c 小鼠30 只，隨機(jī)分為5 組：Con 組、Sevo-1 組、Sevo-2組、E-1 組和E-2 組。處理措施同實(shí)驗(yàn)1.1。在相應(yīng)時間點(diǎn)斷

7、頭，取感覺皮質(zhì)、海馬、腦干行Western blotting 測定腦內(nèi)pCREB 表達(dá)情況。 第三部分 1. 磷酸化PKCγ在正常小鼠腦內(nèi)的免疫組織化學(xué)定位雄性BALB/c 小鼠8 只，脫臼處死，灌流取腦，免疫組織化學(xué)染色，觀察pPKCγ陽性反應(yīng)產(chǎn)物在腦內(nèi)的分布。 2. 小鼠七氟醚麻醉－蘇醒過程中腦內(nèi)磷酸化PKCγ的表達(dá)變化雄性BALB/c 小鼠48 只，隨機(jī)分為4 組：對照組(Con)、七氟醚麻醉5min組(S

8、evo-1)、七氟醚麻醉1h 組(Sevo-2)和麻醉1h 后停藥1h 組(E-1h)。在相應(yīng)時間點(diǎn)斷頭取樣行Western blotting，灌注取腦切片行免疫組織化學(xué)染色，以觀察七氟醚麻醉－蘇醒過程中小鼠腦內(nèi)pPKCγ的表達(dá)變化。 結(jié)果 第一部分 1. 小鼠七氟醚麻醉－蘇醒過程中腦內(nèi)磷酸化ERK1/2 的表達(dá)變化Western blotting 結(jié)果：與Con 組相比，麻醉后各組動物感覺皮質(zhì)、海馬pERK 表

9、達(dá)水平下降，蘇醒后回升至對照組水平(E-1, E-2)，而腦干在麻醉后pERK 表達(dá)水平上升，且蘇醒后仍未降至對照組水平。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)外側(cè)網(wǎng)狀核、孤束核、EW 核、臂旁外側(cè)核背側(cè)亞核(LPBD)、視上核(SO)、下丘腦室旁核(PVN)、杏仁中央核和終紋床核在Con 組弱表達(dá)，Sevo-1、Sevo-2及E-1 三組表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05)，而在E-2 組表達(dá)減弱，除LPBD、SO、PVN 外在其余各核團(tuán)均恢復(fù)至對照組水平。而

10、室周灰質(zhì)腹外側(cè)部、丘腦室旁核、弓狀核則表達(dá)相反：Con 組高表達(dá)，Sevo-1，Sevo-2 及E-1 三組陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著減少(P<0.05)，E-2 組恢復(fù)至Con 組水平。此外，海馬、邊緣前皮質(zhì)、扣帶回、運(yùn)動皮質(zhì)、感受皮質(zhì)則表現(xiàn)為Con 組高表達(dá)，Sevo-1 組和Sevo-2組低表達(dá)，E-1 和E-2 組恢復(fù)至對照組水平。 2. 七氟醚麻醉下小鼠的血?dú)怆娊赓|(zhì)狀況1MAC 七氟醚麻醉1h，小鼠血?dú)饧半娊赓|(zhì)情況與對照組相比

11、無改變。 3. MEK1/2 拮抗劑SL327 對七氟醚麻醉行為的影響SL327 組與對照組相比，翻正反射消失時間及夾尾反射恢復(fù)時間均縮短，而DMSO 組與Con 組無差異。Western blotting 顯示：SL327 組動物的感覺/運(yùn)動皮質(zhì)、海馬pERK1/2 表達(dá)水平均較對照組顯著降低(P<0.05)，而DMSO組與Con 組無差異。 第二部分 小鼠七氟醚麻醉－蘇醒過程不同腦區(qū)磷酸化CREB 的表達(dá)變化

12、各組間感覺皮質(zhì)、海馬、腦干在麻醉－蘇醒過程中pCREB 表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。 第三部分 1. 磷酸化PKCγ在正常小鼠腦內(nèi)的免疫組織化學(xué)定位pPKCγ陽性產(chǎn)物主要見于神經(jīng)元的胞漿和突起中，在正常小鼠腦內(nèi)表達(dá)廣泛。僅有少量膠質(zhì)細(xì)胞被染色，著色淺淡。海馬CA1 區(qū)錐體細(xì)胞，小腦的浦肯野細(xì)胞，大腦新皮質(zhì)V 層細(xì)胞，邊緣前皮質(zhì)、島皮質(zhì)的深層細(xì)胞以及前梨皮質(zhì)的顆粒層細(xì)胞，外側(cè)嗅束核、杏仁基底外側(cè)核和杏仁外側(cè)核的神經(jīng)元，以及穹窿、錐體

13、束纖維等均有強(qiáng)或較強(qiáng)的pPKCγ表達(dá)。吻側(cè)丘腦大多數(shù)核團(tuán)，尾側(cè)丘腦的內(nèi)側(cè)膝狀體核及外側(cè)膝狀體的背側(cè)核，腦干耳蝸背側(cè)核的表淺部位，三叉神經(jīng)感覺核簇及巨細(xì)胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)神經(jīng)元中均有弱陽性表達(dá)。 2. 小鼠七氟醚麻醉－蘇醒過程中腦內(nèi)磷酸化PKCγ的表達(dá)變化Western blotting 示海馬pPKCγ表達(dá)在對照組低表達(dá)，麻醉后表達(dá)增強(qiáng)，在E-1h 組回落至Con 組水平。免疫組織化學(xué)染色顯示：在Con 組，錐體束和穹窿中pPKCγ呈高

14、水平表達(dá)，而Sevo-1 和Sevo-2 組表達(dá)顯著減弱，E-1h組恢復(fù)至對照組水平。杏仁基底外側(cè)核pPKCγ表達(dá)則不同：在Con 組低水平表達(dá)，而Sevo-1、Sevo-2 和E-1h 組均呈現(xiàn)高水平表達(dá)(P<0.05)。 結(jié)論 1. 在麻醉－蘇醒過程中，腦內(nèi)某些核團(tuán)、腦區(qū)其pERK1/2 水平出現(xiàn)與麻醉表象一致的變化。根據(jù)已有知識和資料分析，部分pERK1/2 表達(dá)升高的核團(tuán)如LPBD、PVN 等可能與麻醉造成的應(yīng)激

15、反應(yīng)有關(guān)；而另一些pERK1/2水平下調(diào)的核團(tuán)如M、S、Hip 等，可能與麻醉引起意識與感覺認(rèn)知缺失有關(guān)。 七氟醚麻醉－蘇醒過程中，總ERK1/2 表達(dá)未發(fā)生改變，主要是ERK 磷酸化水平的上調(diào)或下調(diào)，提示麻醉主要影響ERK 通路的活化水平，而不涉及新的(de novo)蛋白質(zhì)合成。 2. MEK-ERK 通路特異阻斷時，全麻誘導(dǎo)加快，蘇醒迅速，從功能行為學(xué)上進(jìn)一步證實(shí)了ERK 可能在全麻不同時程中介導(dǎo)不同效應(yīng)，其確切機(jī)

16、制尚待進(jìn)一步深入研究。 3. 作為ERK 通路的下游分子之一，pCERB 在七氟醚麻醉－蘇醒過程中各組間表達(dá)無差異，提示CREB 通路可能不參與此過程的調(diào)節(jié)或CREB 介導(dǎo)的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄機(jī)制在所觀察的時間點(diǎn)尚未激活。 4. 在正常狀態(tài)及麻醉－蘇醒過程中pPKCγ表達(dá)變化的觀察顯示，傳導(dǎo)束中的pPKCγ在七氟醚麻醉時磷酸化水平減弱，提示全麻可能抑制了pPKCγ在軸突中的功能，是否進(jìn)而影響了軸突轉(zhuǎn)運(yùn)或興奮傳導(dǎo)尚待進(jìn)一步研究。