ACE2通過下調(diào)AT1受體和ERK1-2的磷酸化而抑制平滑肌細(xì)胞的增殖.pdf

1、目的:探討血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）2過表達(dá)后對血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）和細(xì)胞外基質(zhì)激酶（ERK）1/2磷酸化水平及細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)一步探究ACE2與血管緊張素Ⅱ之間的相互作用關(guān)系，明確ACE2對平滑肌細(xì)胞增殖影響的機(jī)制。
　　方法:SD大鼠胸主動脈平滑肌離體細(xì)胞原代以及傳代培養(yǎng)；利用293T細(xì)胞濃縮和擴(kuò)增慢病毒表達(dá)載體并采用稀釋法測定其病毒滴度；將載有ACE2基因慢病毒表達(dá)載體（Lentiviral-ACE2）以轉(zhuǎn)染復(fù)

2、數(shù)為10（MOI=10）轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞，分別在mRNA水平和蛋白水平檢測其轉(zhuǎn)染效率并且在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)；AngⅡ分別在不同時間以及不同作用濃度下干預(yù)平滑肌細(xì)胞，使用免疫印跡法檢測SD大鼠固有的ACE2表達(dá)水平；免疫印跡法檢測ACE2過表達(dá)后對AT1受體表達(dá)及ERK1/2磷酸化的的影響；采用CCK-8法檢測ACE2對平滑肌細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果:成功的培養(yǎng)和鑒定了離體培養(yǎng)的SD大鼠平滑肌細(xì)胞；成功濃縮和擴(kuò)增慢

3、病毒表達(dá)載體并且測得慢病毒滴度為2x106TU/L；載有ACE2基因的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞不同時間（24、48、72、96h）后其蛋白表達(dá)量較對照組和空載體組顯著升高，(1.22±0.06vs0.53±0.03和0.53±0.09，p<0.05，n=4），同時ACE2mRNA較對照組和空載體組顯著增加；AngⅡ干預(yù)平滑肌細(xì)胞12小時后能有效下調(diào)平滑肌細(xì)胞ACE2蛋白的表達(dá)并且最適濃度為10-7mol/L；ACE2能夠顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的平滑

4、肌細(xì)胞增殖（0.68±0.03vs0.53±0.10,p<0.05，n=5）,并且在無外源性AngⅡ作用時也具有抑制平滑肌細(xì)胞增殖的作用；AngⅡ(10-7mol/L)作用平滑肌細(xì)胞12小時后AT1R顯著上調(diào)（0.24±0.01vs0.12±0.01，p<0.05），同時ACE2蛋白過表達(dá)顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的AT1受體的上調(diào)(0.72±0.08vs0.34±0.07，p<0.05，n=4)；AngⅡ干預(yù)平滑肌細(xì)胞5min后ERK1/2