藤黃酸通過(guò)調(diào)節(jié)PDGF受體β酪氨酸磷酸化及Rac1活性抑制大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移.pdf

1、血管平滑肌細(xì)胞異常的增殖和遷移在動(dòng)脈硬化和血管損傷后再狹窄中起著重要的作用。而PDGF(platelet derived growth factor，血小板衍生生長(zhǎng)因子)是已知重要的血管平滑肌細(xì)胞異常增殖與遷移的刺激因子。較多的證據(jù)顯示PDGF-BB和PDGF受體β介導(dǎo)的信號(hào)通路在血管重塑和血管損傷后新生內(nèi)膜形成中起著極其重要的作用。因此，在病變形成過(guò)程中，它常被作為一個(gè)藥物治療戰(zhàn)略的靶點(diǎn)。PDGFR的激活與一系列酪氨酸同源區(qū)2相關(guān)的蛋

2、白有關(guān)，包括：RasGAP，磷脂酰肌醇(-3)激酶(P13K)和磷脂酶C(PLC)γ1，這些分子又進(jìn)一步誘導(dǎo)特異性信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活PDGFR下游信號(hào)ERK，AKT，JNK和小分子蛋白rho及Rac1，這些信號(hào)參與了PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)：增殖和遷移。
　　 Rac1屬于Rho GTP酶家族，既往報(bào)道Rac1活化在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期調(diào)控及凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。除此之外，在一些細(xì)胞系中PDGF-BB可通過(guò)激活G-

3、蛋白：Rac1和Cdc42，并在在其增殖和運(yùn)動(dòng)起著重要的作用。β-catenin是一種細(xì)胞骨架蛋白，由位于染色體3p21-22的ctnnb1基因編碼。當(dāng)受到細(xì)胞因子激活后，β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活轉(zhuǎn)錄因子引起細(xì)胞的增殖，已有報(bào)道在血管平滑肌細(xì)胞的增殖中起著重要的作用。β-catenin入核受經(jīng)典的wnt激活，也受JNK、AKT、E-cadherin等分子的調(diào)控。Wu等的文章表明Rac1和JNK活化能促進(jìn)β-catenin進(jìn)入

4、細(xì)胞核并調(diào)控細(xì)胞的增殖和胚胎肢體的長(zhǎng)出。PDGF-BB能誘導(dǎo)β-catenin進(jìn)入血管平滑細(xì)胞核并促進(jìn)其增殖與遷移，但Rac1活化是否在PDGF-BB誘導(dǎo)的β-catenin核內(nèi)聚集中起著重要的調(diào)控作用卻不清楚。
　　 藤黃樹(shù)產(chǎn)自中國(guó)及東南亞地區(qū)，中醫(yī)藥文獻(xiàn)報(bào)道藤黃樹(shù)脂具有較強(qiáng)的止血、抗炎、抗氧化和抗感染作用。藤黃酸是(Gambogic Acid，GA)藤黃樹(shù)脂中提取的有效成分，既往的研究報(bào)道GA可通過(guò)抑制AKT，ERK，c-S

5、rc，F(xiàn)AK和VEGFR2等起到較強(qiáng)的抗癌、抗炎和抑制血管新生的作用。但GA是否能抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移以及其內(nèi)在的分子機(jī)制尚未可知。
　　 本研究發(fā)現(xiàn)：Rac1與JNK相互作用在PDGF-BB誘導(dǎo)的β-catenin核內(nèi)聚集中起著重要調(diào)節(jié)作用，而GA通過(guò)影響PDGFR酪氨酸磷酸化及Rac1活性抑制了大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移。本研究分2部分，現(xiàn)摘要如下：
　　 第一部分：
　　

6、PDGF-BB激活Rac1調(diào)控大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞β-catenin的核內(nèi)外分布
　　 目的：既往的研究基礎(chǔ)提示JNK和Rac1可能在PDGF-BB刺激引起的β-catenin入核中可能起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。因此本研究觀察了JNK與Rac1的相互作用及其在PDGF-BB誘導(dǎo)β-catenin核內(nèi)外分布和細(xì)胞增殖及遷移的作用。
　　 方法：(1)取SD大鼠胸主動(dòng)脈貼塊法培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，并依靠細(xì)胞的形態(tài)和免疫組織化學(xué)

7、方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。(2)設(shè)計(jì)大鼠Rac1siRNA三對(duì)，western法篩選，最有效者應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。(3)CCK8試劑盒和Transwell小室分別檢測(cè)不同濃度Rac1抑制劑NSC23766(25、50、100μmol/L)和Rac1siRNA(50nmol/L)對(duì)PDGF-BB(50μg/L)誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響。(4)為確定PDGF-BB對(duì)Rac1活性、pi-JNK表達(dá)和β-catenin核內(nèi)聚集的時(shí)間特性，PDGF

8、-BB刺激后在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)上述指標(biāo)的變化，分別于PDGF-BB刺激0、1、5、15、30、60min后應(yīng)用GST-pulldown法檢測(cè)Rac1活性，0、5、15、30、60、120min應(yīng)用western blotting檢測(cè)pi-JNK的表達(dá)，0、15、30、60、120、240min提取胞漿-胞核蛋白western blotting檢測(cè)β-catenin核內(nèi)表達(dá)。(5)為檢測(cè)Rac1活化對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的β-catenin的

9、核內(nèi)聚集和pi-JNK的影響。血管平滑肌細(xì)胞給予NSC23766和Rac1siRNA處理后，予以PDGF-BB刺激相應(yīng)時(shí)間，檢測(cè)Rac1活性受到抑制后PDGF-BB誘導(dǎo)的β-catenin的核內(nèi)聚集和pi-JNK表達(dá)的變化。(6)為檢測(cè)JNK的磷酸化是否對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的β-catenin的核內(nèi)聚集和Rac1活化也有作用，血管平滑肌細(xì)胞給予SP600125處理后，予以PDGF-BB刺激相應(yīng)時(shí)間，檢測(cè)JNK磷酸化受到抑制后PDGF-B

10、B誘導(dǎo)的β-catenin的核內(nèi)聚集和Rac1活性表達(dá)的變化。(7)為進(jìn)一步證實(shí)Rac1和JNK活化對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)β-catenin核內(nèi)聚集的影響，血管平滑肌細(xì)胞予以NSC23766、Rac1siRNA和SP600125處理后，PDGF-BB刺激1h后免疫熒光檢測(cè)β-catenin的核內(nèi)外分布變化。
　　 結(jié)論：Rac1活化與JNK的磷酸化之間存在相互作用，并在PDGF-BB誘導(dǎo)血管平滑細(xì)胞β-catenin核內(nèi)聚集中起著

11、關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，抑制Rac1活化能顯著抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。
　　 第二部分：
　　 藤黃酸通過(guò)調(diào)節(jié)PDGFR酪氨酸磷酸化及Rac1活性抑制大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移
　　 目的：藤黃酸是(Gambogic Acid，GA)藤黃樹(shù)脂中提取的有效成分，既往的研究報(bào)道GA可通過(guò)抑制AKT，ERK，c-Src，F(xiàn)AK和VEGFR2等起到較強(qiáng)的抗癌、抗炎和抑制血管新生的作用。但G

12、A是否能抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移以及其內(nèi)在的分子機(jī)制尚未可知。本實(shí)驗(yàn)對(duì)GA是否影響了PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，以及其對(duì)增殖與遷移產(chǎn)生抑制作用的內(nèi)在分子分子機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　 方法：(1)MTT法和[3H]-胸腺嘧啶摻入法檢測(cè)了不同濃度GA(0.25μmol/L，0.5μmol/L，1.0μmol/L，2.0μmol/L)對(duì)PDGF-BB和EGF誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響。(2)

13、流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度GA對(duì)PDGF-BB和EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換的影響。(3)PI/Annexin熒光雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)GA是否造成了細(xì)胞的死亡或凋亡。(4)Transwell小室檢測(cè)了不同濃度GA(0.25μmol/L，0.5μmol/L，1.0μmol/L，2.0μmol/L)對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響。(5)Western blotting檢測(cè)了不同濃度GA對(duì)EGF誘導(dǎo)的EGFR、PDGF-BB誘導(dǎo)的PDG

14、FR及其下游信號(hào)PLCγ1，ERK，AKT，JNK活化的影響，以及對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白(cyclinD1，cyclinE，CDK2和CDK4)的影響。(5)GST-pulldown法檢測(cè)不同濃度GA對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的Rac1活化的影響。(6)為進(jìn)一步檢測(cè)GA作用的分子機(jī)制，酪氨酸活性檢測(cè)(酪氨酸磷酸化表達(dá))和斑點(diǎn)結(jié)合實(shí)驗(yàn)被應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)GA是否造成PDGF-BB和EGF誘導(dǎo)的酪氨酸磷酸化障礙以及GA是否在體外與PDGF-BB和EG