PAK5通過磷酸化GATA1下調(diào)乳腺細胞E-cadherin的表達.pdf

1、目的:
　　PAK(p21 activated kinase)為一類保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過其下游眾多的激酶底物和結(jié)合蛋白參與眾多的生物學(xué)功能，例如:細胞變形、運動、存活、基因轉(zhuǎn)錄和激素信號傳導(dǎo)等[1-5]，目前被認為是腫瘤細胞信號網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，最近報導(dǎo)PAKs還與神經(jīng)系統(tǒng)疾病和感染性疾病有關(guān)[6]。迄今鑒定的PAK家族成員包括六個成員:PAK1-PAK6，根據(jù)結(jié)構(gòu)相似性分為兩類，Ⅰ類包括PAK1-3，Ⅱ類包括PA

2、K4-6。兩類PAK在結(jié)構(gòu)上包括N末端保守的PBD結(jié)構(gòu)域(p21 binding domain)和C末端保守的激酶域(kinase domain，KD)[7]。兩類PAK結(jié)構(gòu)上最大的差別是Ⅰ類PAK在N-末端含有一個與PBD部分重疊的自我抑制域(auto-inhibitory domain，AID)，而Ⅱ類PAK沒有，因此二類PAK在活化方式及生物學(xué)功能上存在差異。
　　PAK4是Ⅱ類PAK中最早被鑒定的，也是Ⅱ類PAK中研究的最

3、為廣泛的成員，但是目前發(fā)現(xiàn)的PAK4相互作用蛋白仍然十分有限，對PAK4的研究仍處于起步階段。因此我們利用酵母雙雜交技術(shù)從人胎腦文庫中篩選出若干PAK4相互作用蛋白，其中LMO2就是一個新的PAK4相互作用蛋白。為了探討LMO2與PAK4的相互作用在PAK家族中是否具有特異性，我們采用TNT結(jié)合GSTpull-down實驗將LMO2和PAK1/2/4/5/6分別作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LMO2不僅能與PAK4，還能與PAK1/5結(jié)合，其中與PAK

4、5的結(jié)合是最強的。鑒于LMO2是一個重要的轉(zhuǎn)錄輔因子[8]，PAK5又能夠經(jīng)過細胞外信號刺激實現(xiàn)‘核漿穿梭’，而且PAK5的核內(nèi)功能一無所知[9]，所以我們將研究的重點轉(zhuǎn)向了PAK5與LMO2相互作用所引起的生物學(xué)功能研究。
　　PAK5是最新發(fā)現(xiàn)，且研究最少的PAK家族成員。PAK5在神經(jīng)組織中表達水平很高，其在細胞骨架調(diào)節(jié)方面具有重要作用。通過Cdc42/Rac通路，PAK5能促進N1E-115細胞神經(jīng)軸突和絲狀偽足的形成[1

5、0]。而且，PAK5同PAK1一樣，在由鳥苷酸交換因子(GEFT)所引起的神經(jīng)突向外生長和樹突棘的形成過程中是必須的[11]。另外，MARK通過磷酸化微管相關(guān)蛋白Tau使其從微管上脫離下來，從而使微管解聚。而PAK5可以直接與MARK相互作用并使其失活，負向調(diào)節(jié)Tau的磷酸化，從而起到穩(wěn)定微管的作用[12]。在神經(jīng)細胞中，PAK5也可以通過磷酸化cofilin來調(diào)節(jié)肌動蛋白重組[13]。最近有報導(dǎo)稱PAK5有通過調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細胞黏附和遷移

6、能力的變化，從而促進其運動的作用，但具體機制不詳[14]。到目前為止，PAK5行使生物學(xué)功能的場所全部位于細胞漿內(nèi)，核內(nèi)功能一片空白，而PAK5在血清的刺激下是可以入核的，這提示PAK5可能存在一些不為人知的核內(nèi)功能[9]。本研究就是重點論述PAK5入核后調(diào)節(jié)E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄的功能。
　　LMO2(LIM domain Only protein2)于1991年發(fā)現(xiàn)，染色質(zhì)異位或逆轉(zhuǎn)錄病毒插入都能導(dǎo)致LMO2基因非正常激

7、活，導(dǎo)致急性T淋巴細胞白血病[15-17]。同時LMO2是一個重要的轉(zhuǎn)錄輔因子，它常與GATA1/E47/LDB1/TAL1形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，參與多個基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[18-22]。其中轉(zhuǎn)錄因子GATA1發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，LMO2又常常能與其直接結(jié)合增強GATA1對某個基因的調(diào)節(jié)作用[23-25]。而我們發(fā)現(xiàn)PAK5又能與LMO2直接相互作用，提示PAK5也可能有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能，這對于PAK5的研究是一個全新的領(lǐng)域。
　　早期發(fā)現(xiàn)

8、GATA1與造血功能密切相關(guān)，其作為一個的轉(zhuǎn)錄激活子可促進紅細胞分化成熟[26-28]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)GATA1可參與調(diào)節(jié)眾多基因的表達，其中多數(shù)調(diào)節(jié)是促進的，少數(shù)是抑制的[29-31]。作為一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，GATA1可特異識別并結(jié)合基因啟動子區(qū)上經(jīng)典的(T/A) GATA(A/G)序列，后來發(fā)現(xiàn)GATA1還可結(jié)合非經(jīng)典的GATT和CATC序列[32-34]。另外，GATA1常與轉(zhuǎn)錄因子E47通過LMO2、LDB1和TAL1的

9、連接形成一個典型的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，E47結(jié)合在E-box(CACCTG/CAGGTG)上，而GATA1就結(jié)合在附近的GATA框GATA/GATT/CATC上[35-37]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)并證實了GATA1可結(jié)合在E-cadherin啟動子上的CATC(-344/-341)序列上，對其進行抑制調(diào)節(jié)。
　　E-cadherin是一種重要的細胞間黏附因子，其表達的缺少是發(fā)生上皮樣向間質(zhì)樣分化(EMT)的標志，而EMT是

10、上皮細胞發(fā)展成具有轉(zhuǎn)移能力的癌細胞過程的早期病變事件[38-39]。因此，對E-cadherin的調(diào)節(jié)顯得尤為重要。到目前為止，共有6到8個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子參與調(diào)節(jié)E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄和腫瘤EMT的發(fā)生，他們包括直接結(jié)合在E-cadherin啟動子上的抑制子:SNAI1，SLUG，SIP1和E47，間接結(jié)合的有:TWIST1，F(xiàn)OXC2，F(xiàn)OXC1，GSC和ZEB1[40-43]。而在本研究中，我們又發(fā)現(xiàn)了一個新的能直接結(jié)合在E-ca

11、dherin啟動子上的轉(zhuǎn)錄抑制子GATA1。他可通過招募HDAC3/4對染色質(zhì)進行重塑，使E-cadherin基因發(fā)生去乙酰化，達到抑制其表達的效應(yīng)。
　　去乙酰化(Deacetylation)，磷酸化(Phosphorylation)，類泛素化(SUMOylation)是蛋白質(zhì)翻譯后的三種修飾作用。其中磷酸化是一種蛋白激酶使其底物在特定氨基酸標記上磷酸基團的生化反應(yīng)，與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期、基因轉(zhuǎn)錄等密切相關(guān)44];去乙?；窃诮M

12、蛋白去乙?；?HDACs)的作用下使組蛋白發(fā)生去乙?；倪^程，它通常與基因的轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)[45];而類泛素化在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和功能中起著關(guān)鍵的作用，包括調(diào)節(jié)蛋白相互作用、蛋白核漿轉(zhuǎn)運、基因轉(zhuǎn)錄和拮抗泛素降解等，后者能使轉(zhuǎn)錄因子或輔因子穩(wěn)定性提高，增強轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)效應(yīng)[46]。
　　本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了一個新的PAK5相互作用蛋白LMO2，而且LMO2可以作為一個橋梁分子將PAK5和GATA1間接地連接起來，形成一個全新的轉(zhuǎn)錄復(fù)合

13、體PAK5/LMO2/GATA1。而對于這一新的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體是如何下調(diào)E-cadherin的表達的？我們也進行了較為深入的探討。我們發(fā)現(xiàn):一方面，PAK5通過LMO2可磷酸化GATA1，這將促進GATA1的類泛素化(SUMOylation)，提高GATA1的穩(wěn)定性，使其免于泛素降解，而且SUMO化的GATA1能招募更多的HDAC3/4結(jié)合到E-cadherin啟動子上，使其發(fā)生去乙?；?，從而抑制E-cadherin的表達;另一方面，PAK

14、5還能促進GATA1蛋白的表達，我們猜測PAK5入核后可能會促進GATA1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，雖然我們在此沒有深入研究。但是這將使活化的GATA1在細胞核內(nèi)富集，促進其對E-cadherin的抑制作用。這可能會是新型轉(zhuǎn)錄復(fù)合體PAK5/LMO2/GATA1對E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄翻譯抑制的機制。
　　材料與方法:
　　一、轉(zhuǎn)錄復(fù)合體PAK5/LMO2/GATA1的形成
　　1、用酵母配合實驗和GST-pull do

15、wn實驗證實PAK4與LMO2的相互作用。
　　2、用GST-pull down實驗證實PAK4與LMO家族蛋白作用的特異性，反之證實LMO2對PAK家族蛋白作用的特異性。
　　3、用免疫共沉淀(Co-IP)的方法證實PAK5與LMO2的結(jié)合。
　　4、用胎牛血清(FBS)刺激，結(jié)合共焦激光掃描顯微鏡觀察PAK5入核的時間點及其與LMO2在細胞核內(nèi)的共定位。
　　5、用GST-pull down和免疫共沉淀（Co

16、-IP）的方法證實PAK5參與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體PAK5/LMO2/GATA1的形成。
　　6、用GST-pull down實驗證實LMO2是連接PAK5和GATA1的橋梁分子，并且找到PAK5和GATA1分別結(jié)合到LMO2上的區(qū)域。
　　7、結(jié)合GST-pull down和免疫共沉淀（Co-IP）的結(jié)果，繪制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體PAK5/LMO2/GATA1的轉(zhuǎn)錄模型。
　　二、轉(zhuǎn)錄復(fù)合體PAK5/LMO2/GATA1對E-cadhe

17、rin基因的下調(diào)
　　1、用Western Blot方法檢測PAK5、LMO2、GATA1、E-cadherin在幾種乳腺相關(guān)細胞中的表達情況。
　　2、用Dual-Luciferase Reporter Assay System探討轉(zhuǎn)錄復(fù)合體PAK5/LMO2/GATA1及其成員對E-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。
　　3、用Dual-Luciferase Reporter Assay System、免疫共沉淀

18、(Co-IP)及免疫熒光(IF)結(jié)合共焦激光掃描顯微鏡的方法證實截掉出核信號(NES)的PAK5ΔNES(30～83，401～411aa)突變體能與LMO2結(jié)合并下調(diào)E-cadherin。
　　4、用Dual-Luciferase Reporter Assay System驗證GATA1在三種不同細胞系中對E-cadherin基因都有下調(diào)作用。
　　5、用Western Blot檢測不同劑量和不同時間點的GATA1表達對E-

19、cadherin蛋白表達的影響。
　　6、用免疫熒光(IF)結(jié)合共焦激光掃描顯微鏡的方法檢測GATA1對細胞連接的影響。
　　7、用RNA干擾結(jié)合Transwell小室的方法探討沉默掉GATA1后對E-cadherin蛋白表達和細胞遷移力的影響。
　　8、用生物信息學(xué)的方法分析E-cadherin基因啟動子區(qū)域的GATA1結(jié)合序列。
　　9、用Dual-Luciferase Reporter Assay Syst

20、em分析GATA1對不同E-cadherin基因啟動子截短突變體的抑制作用，尋找并證實GATA1確切的結(jié)合位點。
　　10、用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）的方法證實GATA1能結(jié)合在E-cadherin基因啟動子上。
　　三、轉(zhuǎn)錄復(fù)合體PAK5/LMO2/GATA1對E-cadherin基因下調(diào)的機制研究
　　1、用Dual-Luciferase Reporter Assay System分析GATA1是否能招募組蛋白去

21、乙酰化酶HDACs對E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄進行抑制。
　　2、轉(zhuǎn)染不同劑量的HDAC3/4和用組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA處理后檢測GATA1和HDAC3/4對E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄的影響。
　　3、用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)和ChIP-Re-IP的方法證實GATA1能直接招募HDAC3/4結(jié)合在E-cadherin基因啟動子上。
　　4、用GST-pull down、免疫共沉淀(Co-IP)及免疫熒光(

22、IF)結(jié)合共焦激光掃描顯微鏡的方法證實GATA1與HDAC3/4的相互作用。
　　5、用體外激酶實驗探討PAK5對LMO2和GATA1的磷酸化情況。
　　6、用Dual-Luciferase Reporter Assay System分析PAK5的激酶活性對E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄的影響。
　　7、用Western Blot方法檢測PAK5的激酶活性對GATA1蛋白表達及類泛素化（SUMOylation）水平的影響

23、。
　　8、用免疫共沉淀(Co-IP)的方法探討PAK5的激酶活性對GATA1類泛素化(SUMOylation)水平的影響。
　　9、用免疫共沉淀(Co-IP)的方法證實E3泛素連接酶PIASy存在于PAK5/LMO2/GATA1/HDAC3/4轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中。
　　10、用免疫共沉淀（IP）的方法證實SUMO化的GATA1能招募更多的HDAC3/4，抑制E-cadherin的表達。
　　結(jié)果:
　　1、LM

24、O2是PAK5的一個新的相互作用蛋白。
　　2、PAK5可在胎牛血清(FBS)的刺激下入核，并與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄輔因子LMO2共定位。
　　3、PAK5可參與LMO2/GATA1/LDB1/E47/TAL1轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成，并可與其中的LMO2、E47、LDB1直接結(jié)合。
　　4、通過橋梁分子LMO2，PAK5可與轉(zhuǎn)錄因子GATA1間接結(jié)合，形成全新的PAK5/LMO2/GATA1轉(zhuǎn)錄復(fù)合體。
　　5、PAK5和GATA

25、1可分別與LMO2的兩個鋅指結(jié)構(gòu)域LIM1，LIM2結(jié)合，不競爭同一結(jié)合位點，充分體現(xiàn)了LMO2連接PAK5和GATA1的橋梁作用。
　　6、PAK5可通過與LMO2，GATA1的相互作用實現(xiàn)對E-cadherin表達的抑制。
　　7、截掉出核信號(NES)的PAK5△NES(30～83，401～411aa)突變體，絕大部分定位于細胞核中，且依然能與LMO2相互作用，抑制E-cadherin的表達。
　　8、轉(zhuǎn)錄因子G

26、ATA1的過表達可抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄和翻譯，使細胞連接松散。
　　9、沉默掉GATA1，E-cadherin的表達上調(diào)，細胞的遷移能力下降。
　　10、PAK5可增強GATA1對E-cadherin的抑制作用，從而引發(fā)EMT。
　　11、GATA1可結(jié)合在E-cadherin啟動子的CATC(-344/-341)序列上。
　　12、GATA1可通過招募HDAC3/4對染色質(zhì)進行修飾，從而抑制E-cad

27、herin的表達。
　　13、PAK5激酶可以磷酸化GATA1，但不能磷酸化LMO2。
　　14、PAK5可以促進GATA1的表達，但這種促進作用與PAK5的激酶活性無關(guān)，雖然PAK5可以磷酸化GATA1。
　　15、PAK5對GATA1的磷酸化可促進其類泛素化(SUMOylation)水平，提高其穩(wěn)定性，使其免于降解。
　　16、SUMO化的GATA1能招募更多的HDAC3/4，抑制E-cadherin的表達。

28、
　　17、GATA1本身可以抑制E-cadherin的表達，同時PAK5又能促進GATA1的表達和提高其穩(wěn)定性，使其在細胞核內(nèi)富集，從而進一步抑制了E-cadherin的表達。
　　18、PAK5磷酸化GATA1，可促進E3泛素連接酶PIASy對GATA1的類泛素化(SUMOylation)作用，發(fā)生SUMO化的GATA1能招募更多的HDAC3/4，使E-cadherin啟動子發(fā)生去乙酰化，從而達到抑制E-cadherin

29、表達的作用。
　　結(jié)論:
　　1、PAK5可經(jīng)FBS刺激入核，并與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄輔因子LMO2相互作用。
　　2、通過橋梁分子LMO2，PAK5可與轉(zhuǎn)錄因子GATA1形成PAK5/LMO2/GATA1轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，抑制E-cadherin的表達。
　　3、GATA1可結(jié)合在E-cadherin啟動子CATC(-344/-341)序列上，并招募HDAC3/4下調(diào)E-cadherin的表達。
　　4、PAK5的表達，既