PAK5在肝細胞肝癌中的表達和預(yù)后意義.pdf

1、目的:
　　肝細胞肝癌(hepatocellular cancinoma，HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，在所有常見腫瘤中排名第六位，致死率為5.6％，排名第二位。且因其腫瘤惡性程度高，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差，5年生存率低[1]。故如何提高肝癌患者早期診斷率和遠期生存率仍是目前研究的熱點。PAK5(P21 activated kinase5)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是小GTP酶Rac和Cdc42下游的效應(yīng)因子，并且是MAPK信號通

2、路上游的調(diào)控元件之一，能激活調(diào)節(jié)多種信號通路，在調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化、基因轉(zhuǎn)錄以及細胞調(diào)亡、腫瘤形成等過程中起重要作用[2-3]。本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測PAK5在肝癌組織中的表達情況，分析PAK5的表達情況與臨床病理資料及預(yù)后之間的相關(guān)性;通過轉(zhuǎn)染過表達PAK5質(zhì)粒上調(diào)PAK5基因的表達，觀察對肝癌細胞株增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響，為PAK5可能作為肝癌等惡性腫瘤的基因治療靶點提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、通過免疫組

3、化檢測76例肝癌組織及其31例鄰近肝組織的PAK5表達情況，收集肝癌患者的臨床病理資料（包括:性別、年齡、HBsAg、甲胎蛋白、腫塊直徑、腫瘤數(shù)目、被膜累及、門靜脈癌栓、TNM分期等）。統(tǒng)計分析PAK5在肝細胞肝癌中的表達情況與患者臨床病理資料及預(yù)后的相關(guān)性。
　　2、通過提取肝癌組織中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，繼而通過TA克隆、菌落PCR等技術(shù)獲得帶有PAK5基因的質(zhì)粒，再通過與pcDNA3.1（-）載體進行酶切、連接、轉(zhuǎn)化獲

4、得PAK5的重組質(zhì)粒。
　　3、利用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000將體外設(shè)計合成的重組PAK5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肝癌細胞株SMMC7721、MHCC97H，將實驗分成三組:pcDNA3.1（-）+PAK5組，pcDNA3.1（-）組，空白對照組。運用蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測PAK5蛋白的表達水平，運用明膠酶譜試驗測定重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細胞株后MMP-2、MMP-9的活性變化，應(yīng)用劃痕試驗檢測過表達PAK5后細

5、胞遷移能力的變化。
　　結(jié)果:
　　1、PAK5在肝癌癌灶組織及鄰近正常組織中的表達免疫組化結(jié)果顯示PAK5主要在肝癌細胞細胞質(zhì)中表達，為棕黃色或棕褐色顆粒，呈彌漫性分布。PAK5在肝癌組織中的表達水平明顯高于癌旁的正常組織，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=12.962，P＜0.05）。
　　2、PAK5表達與臨床病理因素的關(guān)系PAK5表達與性別（x2=5.063，P=0.024）、腫塊直徑（x2=9.159，P=0.

6、002）、門靜脈癌栓（x2=4.469，P=0.035）相關(guān)，而與年齡（x2=3.146，P=0.076）、HBsAg（x2=0.000，P=1.000）、甲胎蛋白（x2=3.011，P=0.083）、腫瘤數(shù)目(x2=0.005，P=0.941)、被膜累及（x2=0.160，P=0.689）、TNM分期(x2=1.670，P=0.196)未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性。
　　3、PAK5與肝癌預(yù)后的關(guān)系
　　PAK5陽性患者5年生存率為1

7、6.0％(8/50)，陰性患者5年生存率為62.5％(5/8)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=6.110，P=0.013）。Kaplan-Meier法顯示:PAK5陽性患者術(shù)后平均生存時間為23.2月（95％CI:18.2-28.2月），陰性患者術(shù)后平均生存時間為49.1月（95％CI:37.7-60.5月），PAK5陽性表達患者生存時間顯著低于陰性表達患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=7.104，P=0.008）。經(jīng)單因素分析顯示:HBsAg、

8、PAK5表達是影響肝細胞肝癌患者術(shù)后生存時間的危險因素，而年齡、性別、TNM分期、甲胎蛋白、腫塊直徑、腫瘤數(shù)目、被膜累及、門靜脈癌栓與預(yù)后無關(guān)。經(jīng)過Cox比例風(fēng)險回歸模型進一步分析顯示:PAK5可作為肝細胞肝癌患者術(shù)后生存的獨立危險影響因素。
　　4、轉(zhuǎn)染PAK5重組質(zhì)粒后肝癌細胞株蛋白表達水平
　　轉(zhuǎn)染肝癌細胞株SMMC7721、MHCC97H48小時后，Western Blot結(jié)果顯示pcDNA3.1(-)+PAK5組中

9、PAK5蛋白表達水平顯著pcDNA3.1（-）組和空白對照組（P＜0.05）。
　　5、轉(zhuǎn)染PAK5重組質(zhì)粒后增強肝癌細胞遷移能力
　　運用明膠酶譜試驗測定重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細胞株后MMP-2、MMP-9的活性變化，結(jié)果表明pcDNA3.1（-）+PAK5組的MMP-2、MMP-9活性明顯高于pcDNA3.1（-）組和空白對照組（P＜0.05）。應(yīng)用劃痕試驗來檢測肝癌細胞株的遷移能力的變化，結(jié)果表明pcDNA3.1（-）+PA

10、K5組的肝癌細胞遷移能力顯著高于pcDNA3.1（-）組和空白對照組（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、PAK5在肝癌中高表達，且PAK5表達與肝癌患者預(yù)后相關(guān)，是肝癌患者的預(yù)后的獨立影響因素，PAK5在肝細胞肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用。
　　2、PAK5重組質(zhì)粒能有效增強肝癌細胞株SMMC7721、MHCC97H中PAK5的表達，增強肝癌細胞株的遷移轉(zhuǎn)移能力，并可能成為肝細胞肝癌的潛在診斷和治療靶標(biāo)之一。