Cdc20在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與肝癌發(fā)生、預(yù)后的關(guān)系.pdf

1、一、研究背景
　　肝細(xì)胞癌是一種肝臟原發(fā)的惡性腫瘤，其發(fā)病率居世界第五，而死亡率已經(jīng)排在全世界癌癥死亡原因的第三位。先天性的遺傳改變和后天的高危因子例如HBV/HCV的感染、肝硬化、酒精性肝病及黃曲霉素的污染等都是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌高發(fā)的危險(xiǎn)因素。
　　肝細(xì)胞癌經(jīng)常發(fā)生在已經(jīng)病變的肝臟，并且是肝硬化的一個(gè)致命的并發(fā)癥。對(duì)肝臟致癌原理研究的缺乏，以及對(duì)惡性轉(zhuǎn)化阻斷或逆轉(zhuǎn)的失敗，導(dǎo)致了肝細(xì)胞癌病人的不良預(yù)后。臨床上針對(duì)肝細(xì)胞癌的分子靶

2、向治療急需關(guān)鍵的信號(hào)通路。全基因組表達(dá)微陣列分析已經(jīng)找出了導(dǎo)致失控性生長(zhǎng)和異常生存信號(hào)的一些重要通路，而部分關(guān)鍵通路已經(jīng)被驗(yàn)證。但是，還沒(méi)有有意義的基因標(biāo)記或預(yù)后指標(biāo)進(jìn)入到臨床實(shí)踐，因此需進(jìn)一步研究和尋找肝細(xì)胞癌新的診斷及預(yù)后標(biāo)記物。
　　已有研究表明細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的破壞在肝細(xì)胞癌中是一個(gè)重要事件并且能促進(jìn)腫瘤形成。絲裂原調(diào)控子20(Cdc20)是一個(gè)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的調(diào)控因子，它和另一個(gè)調(diào)控因子Cdh1都可直接結(jié)合并激活有絲分裂后

3、期促進(jìn)復(fù)合物APC，在細(xì)胞進(jìn)入分裂后期和退出有絲分裂過(guò)程中起重要作用。近期，越來(lái)越多的研究表明Cdc20是一個(gè)致癌因子，在多種人類(lèi)惡性腫瘤中廣泛表達(dá)上調(diào)，包括胰腺導(dǎo)管腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌及胃癌等，并且與多種腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)。但是Cdc20在肝細(xì)胞癌中的研究還非常有限，其表達(dá)情況及發(fā)揮的作用和作用機(jī)制還并不十分清楚。
　　二、研究目的
　　檢測(cè)Cdc20在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況，探討其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的

4、作用及其與肝癌病人預(yù)后的相關(guān)性，并初步探索Cdc20在肝癌中的分子機(jī)制。
　　三、研究方法
　　1.生物信息學(xué)分析
　　用生物信息學(xué)方法分析公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中GSE14520芯片數(shù)據(jù)并篩選出肝癌和正常肝組織的差異表達(dá)基因，對(duì)這些基因進(jìn)行GO功能分類(lèi)和KEGG信號(hào)通路分析，并構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出在肝癌中起重要作用的靶基因。
　　2.靶

5、基因Cdc20在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)驗(yàn)證
　　用熒光定量RT-PCR及Western blot法分別檢測(cè)16對(duì)新鮮肝癌組織及癌旁正常肝組織中Cdc20的mRNA和蛋白水平。
　　3.Cdc20與肝癌病人的臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系
　　用免疫組化法在132例肝癌病人的癌組織及癌旁正常肝組織石蠟切片中檢測(cè)Cdc20的表達(dá)情況及表達(dá)部位，并分析其表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)及總生存率的關(guān)系。
　　4.SiRNA干擾Cdc20

6、的表達(dá)并檢測(cè)沉默后對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移及下游底物的影響
　　在HepG2細(xì)胞系中用siRNA沉默Cdc20的表達(dá)，用細(xì)胞增殖曲線觀察基因沉默后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速度的影響，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的改變，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的改變。并用western blot檢測(cè)了其下游底物p21的表達(dá)改變。
　　四、研究結(jié)果
　　1.Cdc20是肝細(xì)胞癌分子作用網(wǎng)絡(luò)中重要的靶基因
　　用生物信息學(xué)方法篩選出了137個(gè)肝

7、癌中的差異表達(dá)基因并構(gòu)建了相互作用基因網(wǎng)絡(luò)圖，Cdc20在網(wǎng)絡(luò)圖中居于中心位置并與多個(gè)基因有相互作用，推測(cè)其可能是肝癌中重要的靶基因。
　　2.Cdc20在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)
　　Cdc20的mRNA及蛋白水平在多數(shù)肝癌組織中均表達(dá)上調(diào)(14/16)。
　　3.Cdc20高表達(dá)與多項(xiàng)臨床病理參數(shù)相關(guān)
　　免疫組化檢測(cè)Cdc20在肝癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁正常肝組織(P=0.000)，表達(dá)部位主要位于細(xì)胞核和細(xì)胞

8、質(zhì)中，并且其高表達(dá)與腫瘤的不良分化(P=0.002)及TNM分期相關(guān)(P=0.022)。
　　4.Cdc20是肝細(xì)胞癌的不良預(yù)后因子
　　分析132例病人中75例患者的總生存時(shí)間，5年總生存率為21％。Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)Cdc20表達(dá)分值(P=0.011)、腫瘤大小(P=0.000)、轉(zhuǎn)移(P=0.006)、AFP水平(P=0.032)、腫瘤分化(P=0.000)、TNM分期(P=0.003)、P53(P=0.02)及Ki6

9、7(P=0.004)的表達(dá)均與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，但只有腫瘤大小(P=0.000)、腫瘤分化(P=0.000)及P53的表達(dá)水平(P=0.000)為肝細(xì)胞癌獨(dú)立的預(yù)后因子。
　　5.Cdc20表達(dá)抑制后細(xì)胞生長(zhǎng)速度及遷移能力下降，細(xì)胞周期停滯用siRNA干擾Cdc20的表達(dá)之后，HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)速度減慢，處于G2/M期的細(xì)胞比例增多，但對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響不大。檢測(cè)下游的底物分子發(fā)現(xiàn)Cdc20表達(dá)抑制后p21蛋白表達(dá)明顯增加。