SNF5在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及其與AR關(guān)系的初步研究.pdf

1、目的
　　肝細(xì)胞性肝癌(HCC)是目前我國常見的惡性腫瘤疾病之一，發(fā)病機(jī)制尚未明確。肝癌由于其發(fā)病具有隱匿性，發(fā)現(xiàn)時(shí)多為晚期且預(yù)后較差。且對放療的耐藥性和對化療不敏感，所以肝臟移植和肝臟切除是目前僅有的根治療法，但術(shù)后患者的5年復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率高，已成為臨床治療的難題。因此，研究肝癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制對其預(yù)防和治療具有重要意義。
　　SNF5是染色質(zhì)重塑復(fù)合物SWI/SNF的核心亞基，在一些惡性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)其在腫瘤的發(fā)生發(fā)

2、展中扮演重要角色，但其在肝癌中的表達(dá)情況及其是否有可能參與調(diào)控肝癌的發(fā)生發(fā)展，現(xiàn)未有報(bào)道。SWI/SNF復(fù)合物利用ATP水解釋放的能量使組蛋白和DNA的構(gòu)象發(fā)生局部改變，有助于轉(zhuǎn)錄因子與靶基因的啟動子結(jié)合，從而激活或者抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。哺乳動物SWI/SNF復(fù)合物由9～12個(gè)亞基組成，分為三類:1)ATP酶亞基（BRG1或BRM）;2）核心亞基(hSNF5，BAF155和BAF170);3）副亞基(BAF53，BAF57，BAF180)

3、等。SNF5是該復(fù)合物進(jìn)化上高度保守的核心亞單位之一，為染色質(zhì)重塑功能不可或缺。SNF5是一個(gè)腫瘤抑制因子。研究發(fā)現(xiàn)其遺傳學(xué)的證據(jù)是大多數(shù)的惡性橫紋肌樣瘤中包含SNF5基因位點(diǎn)的雙等位基因失活性突變。在橫紋肌肉瘤細(xì)胞中SNF5的缺失或失活引起AuroraA的高表達(dá)，從而使細(xì)胞有絲分裂紡錘體位點(diǎn)的異常。SNF5缺失也可通過下調(diào)p16INK4或者誘導(dǎo)了因子p21CIP1/WAF1，上調(diào)CyclinD1表達(dá)從而阻斷RB信號通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生

4、發(fā)展。當(dāng)干擾SWI/SNF復(fù)合物時(shí)，會導(dǎo)致侵襲性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　雄激素受體(AR)基因位于X染色體長臂Xqll.2-ql2，存在于這個(gè)基因上編碼序列分為8個(gè)外顯子，它被轉(zhuǎn)錄、加工成mRNA，并進(jìn)一步被譯成蛋白質(zhì)。AR的結(jié)構(gòu)包括羧基端配體結(jié)合區(qū)、DNA結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)、可變長度CAG重復(fù)區(qū)、氨基端激活區(qū)。鉸鏈區(qū)與激素結(jié)合后發(fā)揮受體-激素復(fù)合物的核內(nèi)功能，配體結(jié)合區(qū)的區(qū)域在相關(guān)分子的作用下，可以提高與激素的親和力。AR的作用機(jī)制:

5、在胞質(zhì)中，AR與熱休克蛋白(heatshockprotein，Hsp)結(jié)合，AR與配體（如雄激素）結(jié)合后被激活，Hsp解離，形成二聚體，AR二聚體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中并與其轉(zhuǎn)錄輔助調(diào)控因子形成復(fù)合物，招募到雄激素反應(yīng)元件（androgenresponseelementARE）區(qū)，激活其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明AR信號通路可促進(jìn)HCC的發(fā)生。男性乙肝病毒攜帶者HCC的發(fā)病與雄激素水平的升高有關(guān)性。敲除AR表達(dá)能夠延緩化學(xué)致癌物二乙基亞硝胺(D

6、EN)誘導(dǎo)的雄鼠HCC發(fā)生。在DEN誘導(dǎo)雌鼠HCC腫瘤細(xì)胞中，AR表達(dá)升高。與正常肝組織相比，人HCC組織AR的mRNA及蛋白表達(dá)均升高。雄激素受體信號通路的活化能夠誘導(dǎo)下游靶基因ID1、TGF-β、VEGF等的表達(dá)，促進(jìn)HCC細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等。雄激素陽性的肝癌預(yù)后較雄激素陰性差。因此，研究AR在HCC中作用的具體機(jī)制，將為臨床的診斷提供研究依據(jù)。
　　本課題旨在深入研究SNF5蛋白在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及臨床特征之間的關(guān)系，

7、并對HCC中AR的關(guān)系進(jìn)行初步研究，期待從分子生物學(xué)水平探討SNF5蛋白作為肝癌檢測標(biāo)記的可行性。
　　方法
　　一、SNF5在HCC臨床組織標(biāo)本中的表達(dá)
　　1、用Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測SNF5在HCC臨床組織標(biāo)本中的表達(dá)情況。
　　2、免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測SNF5在HCC臨床組織標(biāo)本中的表達(dá)情況。
　　二、SNF5和AR在HCC細(xì)胞中的表達(dá)及定位
　　1、用Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測SNF

8、5和AR在肝正常細(xì)胞及肝癌細(xì)胞中的表達(dá)。
　　2、共焦激光掃描顯微鏡觀察SNF5與AR的定位。
　　三、SNF5基因克隆及真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
　　1、獲得SNF5編碼序列。
　　2、重組質(zhì)粒的酶切與鑒定。
　　結(jié)果
　　一、SNF5在HCC中的表達(dá)
　　1、SNF5在HCC組織中表達(dá)低于癌周正常組織。
　　2、在肝正常細(xì)胞HL-7702及HCC細(xì)胞HepG2、Hep3B、SMMC-7721

9、和MHCC-LM3細(xì)胞中，SNF5均有表達(dá)。
　　二、SNF5和AR在HCC細(xì)胞中的表達(dá)及定位
　　1、在HCC細(xì)胞中，在無雄激素(DHT)條件下，SNF5在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)。
　　2、在HCC細(xì)胞中，在DHT刺激后，SNF5在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，并且與AR共定位在核內(nèi)。
　　三、SNF5基因克隆及真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
　　克隆了SNF5的表達(dá)序列并構(gòu)建了其真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　結(jié)論