丙型肝炎病毒核心蛋白通過轉(zhuǎn)錄因子Snail下調(diào)E-cadherin表達(dá)的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是威脅人類健康最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一，導(dǎo)致肝癌發(fā)生的原因很多。丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）感染是導(dǎo)致HCC發(fā)生的重要危險因素。全球約有1.7億人感染HCV，其中80％的成年患者將發(fā)展成慢性丙型病毒性肝炎，進(jìn)而進(jìn)展為肝纖維化，肝硬化甚至肝癌。原發(fā)性肝癌病死率高，其中一個主要原因是腫瘤惡性程度高，較早發(fā)生轉(zhuǎn)移。目前許多實(shí)驗(yàn)支持HCV編碼的

2、蛋白，尤其是核心蛋白在HCV相關(guān)肝臟疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮主要的作用，同時還參與HCC的惡性轉(zhuǎn)移過程，但其具體機(jī)制不明。
　　上皮樣細(xì)胞向間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)的過程是上皮細(xì)胞受到刺激后，失去粘著蛋白(E-cadherin)對細(xì)胞之間的緊密連接，上皮細(xì)胞基底膜極性被破壞，細(xì)胞之間變得疏松，并進(jìn)一步獲得間質(zhì)樣細(xì)胞特有的應(yīng)力纖維（fibronectin）、波形蛋白(vimentin)，細(xì)胞最終具有遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移的能力。以往研究者對E

3、MT的認(rèn)識多集中在胚胎發(fā)育期，即EMT在正常的胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，例如EMT參與中胚層、心臟發(fā)育及神經(jīng)嵴的形成。近年來EMT參與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲得到廣泛關(guān)注，有研究報道顯示，在乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肝癌以及黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)EMT參與腫瘤的遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移。但是EMT參與HCV感染相關(guān)的原發(fā)性肝癌惡性轉(zhuǎn)移過程的具體機(jī)制仍不清楚。
　　發(fā)生上皮樣細(xì)胞向間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變(EMT)的細(xì)胞表型改變主要包括:細(xì)胞遷移能力、侵襲能力增強(qiáng)，

4、細(xì)胞凋亡受到抑制。EMT的典型分子標(biāo)志物包括:上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞重要指標(biāo)vimentin，N-cadherin，fibronectin表達(dá)增加，β-catenin出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位;與此同時調(diào)控E-cadherin表達(dá)的抑制性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)，如Snail、Slug、 ZEB1、ZEB2、E47等。
　　粘著蛋白E-cadherin是構(gòu)成細(xì)胞間緊密連接的功能蛋白。當(dāng)缺失E-cadherin時，細(xì)胞的侵襲、

5、轉(zhuǎn)移能力都顯著增加，而回復(fù)腫瘤細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表現(xiàn)為上皮表型，同時細(xì)胞的遷移能力降低;除此之外，異位表達(dá)的E-cadherin，可以使間質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄受阻。因此，E-cadherin的表達(dá)缺失被視為EMT發(fā)生的重要標(biāo)志。
　　研究顯示SNAIL轉(zhuǎn)錄因子超家族Snail通過識別保守的5'-CAGGTG-3'序列，直接與E-cadherin(CDH1)啟動區(qū)上的E-box結(jié)合，負(fù)性調(diào)控CDH1啟動子活

6、性，進(jìn)而抑制E-cadherin的表達(dá)。最新研究表明，肝癌組織中E-cadherin的低表達(dá)與Snail負(fù)相關(guān)，腫瘤組織中高表達(dá)Snail，肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移率高，患者預(yù)后較差。課題組前期實(shí)驗(yàn)表明:體外肝癌細(xì)胞模型中HCV核心蛋白能夠下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，但是HCV核心蛋白能否通過轉(zhuǎn)錄因子Snail下調(diào)E-cadherin表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移，目前還未見報道。本研究旨在進(jìn)一步探討核心蛋白調(diào)控E-cadheri

7、n表達(dá)的分子機(jī)制及參與肝癌發(fā)生惡性轉(zhuǎn)移的作用。
　　方法:采用細(xì)胞劃痕、遷移實(shí)驗(yàn)、RT-PCR、Western blot、免疫熒光及siRNA干擾技術(shù)驗(yàn)證HCV核心蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞由上皮樣細(xì)胞向間質(zhì)樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，分析HCV核心蛋白誘導(dǎo)EMT進(jìn)程的相關(guān)信號通路。進(jìn)一步采用基因重組技術(shù)構(gòu)建E-cadherin(CDH1)啟動子區(qū)報告質(zhì)粒及CDH1啟動子區(qū)E-box突變報告質(zhì)粒，分析HCV核心蛋白對CDH1啟動子活性的調(diào)控作用;通過染色

8、質(zhì)免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation，ChIP)、免疫共沉淀（Immunoprecipitation，IP）方法研究核心蛋白調(diào)控CDH1基因的分子機(jī)制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過裸鼠肝癌皮下移植瘤模型和肝臟原位移植瘤模型，研究HCV核心蛋白對肝癌細(xì)胞增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響。進(jìn)一步采用H&E染色和免疫組化方法檢測裸鼠肝臟原位移植瘤模型中Core、Snail、E-cadherin以及侵襲相關(guān)分子VEGF，MMP-2，

9、MMP-9的表達(dá)。
　　結(jié)果:在瞬時或穩(wěn)定表達(dá)HCV核心蛋白的Huh7細(xì)胞中， HCVCore下調(diào)上皮細(xì)胞重要標(biāo)志物E-cadherin，增強(qiáng)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin的表達(dá)，引起肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，此現(xiàn)象同時在HCV體外復(fù)制模型中得到驗(yàn)證。核心蛋白過表達(dá)的Huh7細(xì)胞中，回復(fù)E-cadherin的表達(dá)可以部分阻斷HCV Core誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，說明HCV Core誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生與細(xì)胞中E-cadheri

10、n的缺失表達(dá)密切相關(guān)。進(jìn)一步研究HCV Core誘導(dǎo)EMT發(fā)生的相關(guān)信號通路發(fā)現(xiàn)，HCV Core對調(diào)控EMT常見信號通路TGF-β無明顯激活作用，其通過激活A(yù)kt/GSK-3β信號通路，增加Snail的穩(wěn)定性，從而抑制 E-cadherin的表達(dá)，引起肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。
　　HCV Core介導(dǎo)Snail結(jié)合于CDH1啟動子區(qū)的E-box1(-80～-75)，E-box3(-30～-25)，E-box4(+22～+27)，抑

11、制CDH1的啟動子活性，其中發(fā)揮主要負(fù)性調(diào)控作用的是E-box1、3，并且兩者之間具有協(xié)同作用。深入分析發(fā)現(xiàn):HCV Core可以增強(qiáng)Snail結(jié)合于CDH1啟動子區(qū)，同時Core還可以與Snail形成復(fù)合物，共同結(jié)合于CDH1啟動子區(qū)，抑制E-cadherin的表達(dá)。因此，在過表達(dá)核心蛋白的Huh7細(xì)胞中證實(shí):HCV Core能與Snail直接結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄。
　　裸鼠肝癌皮下移植瘤模型

12、發(fā)現(xiàn):HCV Core通過穩(wěn)定Snail，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，增強(qiáng)MMP-2、MMP-9、VEGF等的表達(dá)，促進(jìn)異位移植瘤的生長，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。肝臟原位移植瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:HCV Core能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞在肝內(nèi)發(fā)生廣泛性轉(zhuǎn)移，部分裸鼠發(fā)生肺部的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。采用siRNA技術(shù)特異沉默Snail表達(dá)，可以明顯降低HCV Core誘導(dǎo)的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移。E-cadherin的表達(dá)明顯回復(fù)，MMP-2、MMP-9以及

13、VEGF表達(dá)顯著下調(diào)。體內(nèi)皮下移植瘤模型和肝臟原位移植瘤模型的結(jié)果證實(shí):HCV Core增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而沉默Snail的表達(dá)可以明顯抑制Core促腫瘤增殖與遷移效應(yīng)，充分說明Core促腫瘤效應(yīng)依賴轉(zhuǎn)錄因子Snail的參與。
　　結(jié)論:我們通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)HCV Core通過激活A(yù)kt/GSK-3β信號通路穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子Snail，從而下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)HCV感染相關(guān)肝癌細(xì)胞