PAK5介導(dǎo)E47磷酸化促進(jìn)結(jié)腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及肝轉(zhuǎn)移.pdf

1、目的：
　　結(jié)腸癌發(fā)病率在中國(guó)所有腫瘤發(fā)病率中排名第五位，而且上升趨勢(shì)明顯。肝轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌患者的主要致死原因，但是，結(jié)腸癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制目前尚不完全清楚，對(duì)其更深入的研究將有助于預(yù)防和治療結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移。
　　最近研究表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）可能在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移中起主導(dǎo)作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲，轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞耐藥性等。E47是堿性螺旋環(huán)螺旋轉(zhuǎn)錄

2、因子(basic helix-loop-helix transcriptionfactors，bHLH)家族成員之一，能與家族內(nèi)其他成員形成同源二聚體或異源二聚體，結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子上行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。E47是調(diào)控EMT的關(guān)鍵分子之一，能結(jié)合到上皮標(biāo)志蛋白E鈣黏素(E-cadherin)啟動(dòng)子上，抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)波蛋白Vimentin表達(dá)，使上皮細(xì)胞丟失上皮表型，獲得間質(zhì)表型，維持EMT。
　　p21激活激酶

3、(p-21 activated kinase，PAKs)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為Rho家族小鳥苷三磷酸酶(Rho-GTPase) Cdc42/Rac1、生長(zhǎng)因子信號(hào)的下游主要靶蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞周期演進(jìn)、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞轉(zhuǎn)化及介導(dǎo)生存與死亡信號(hào)等多種效應(yīng)，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用。迄今為止PAK家族共發(fā)現(xiàn)6個(gè)成員，根據(jù)其結(jié)構(gòu)相似性，將它們分為兩類，Ⅰ類包括PAK1-3，Ⅱ類包括PA

4、K4、5和6。目前對(duì)PAK5研究表明，PAK5僅在神經(jīng)組織發(fā)育過(guò)程和結(jié)直腸腫瘤組織中表達(dá)，與調(diào)控細(xì)胞骨架和細(xì)胞存活的信號(hào)通路密切相關(guān)。
　　本研究以蛋白質(zhì)相互作用為前提，在證實(shí)PAK5與E47在體內(nèi)外能夠相互作用的基礎(chǔ)上，探討PAK5與E47介導(dǎo)的EMT之間的關(guān)系，及它們對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用，為明確結(jié)腸癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供依據(jù)。
　　方法：
　　一、PAK5與E47在體內(nèi)外相互作用的驗(yàn)證和PAK5磷酸化E4

5、7及其位點(diǎn)的確定
　　1、用GST-pull down實(shí)驗(yàn)鑒定PAK5與E47在體外的相互作用并確定其作用的具體結(jié)構(gòu)域。
　　2、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確定PAK5與E47在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。
　　3、共焦激光掃描顯微鏡觀察PAK5與E47的定位及共定位。
　　4、定點(diǎn)誘變構(gòu)建GST-E47的不同點(diǎn)突變。
　　5、體外激酶實(shí)驗(yàn)確定PAK5磷酸化E47的位點(diǎn)。
　　6、構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒3×Flag-E47SA，

6、3×Flag-E47SD，分別模擬E47激酶死型和激活型。
　　7、Western Blot檢測(cè)腸癌細(xì)胞中PAK5對(duì)E47的磷酸化作用。
　　二、PAK5磷酸化E47促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移及其作用機(jī)制的研究
　　1、Western Blot檢測(cè)結(jié)腸癌新鮮組織樣本中是否表達(dá)PAK5和磷酸化的E47Ser39。
　　2、分析E47 Ser39磷酸化是否和結(jié)腸癌臨床病理分期相關(guān)。
　　3、相差顯微鏡觀察PAK5

7、磷酸化E47對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞形態(tài)變化的影響。
　　4、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)E47，E47 SA，E47SD對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。
　　5、裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型檢測(cè)E47，E47 SA，E47SD是否促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。
　　6、Western Blot檢測(cè)PAK5磷酸化E47對(duì)EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白的影響。
　　7、共焦激光掃描顯微鏡觀察PAK5磷酸化E47對(duì)核定位的影響。
　　結(jié)果：

8、
　　一、PAK5與E47相互作用的驗(yàn)證和PAK5磷酸化E47的確定
　　1、PAK5與E47能夠在體外直接結(jié)合，其作用的具體結(jié)構(gòu)域?yàn)镻AK5結(jié)合E47的1-115aa和301-651aa。
　　2、PAK4與E47能夠在腸癌細(xì)胞HCT116和COLO205內(nèi)相互作用。
　　3、在HCT116細(xì)胞中，PAK5與E47發(fā)生共定位。
　　4、定點(diǎn)誘變構(gòu)建GST-E47的Ser39A，Ser56A，Ser72A，

9、Ser76A，Ser102A，Ser110A點(diǎn)突變。
　　5、體外激酶實(shí)驗(yàn)確定PAK5磷酸化E47的Ser39。
　　6、構(gòu)建分別模擬E47未磷酸化或E47被磷酸化的真核表達(dá)質(zhì)粒3×Flag-E47Ser39A,3×Flag-E47Ser39D。
　　7、Western Blot檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中PAK5對(duì)E47的磷酸化作用。
　　二、PAK5磷酸化E47促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移及其作用機(jī)制的研究

10、　　1、結(jié)腸癌新鮮組織樣本中表達(dá)PAK5表達(dá)和E47 Ser39磷酸化。
　　2、E47 Ser39磷酸化與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移正相關(guān)。
　　3、PAK5磷酸化E47促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞分散生長(zhǎng)。
　　4、過(guò)表達(dá)E47和E47 Ser39D促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移及侵襲，而過(guò)表達(dá)E47Ser39A則不能。
　　5、過(guò)表達(dá)E47和E47 Ser39D促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，而過(guò)表達(dá)E47Ser39A則不能。

11、　　6、PAK5磷酸化E47使上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)降低，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin和Fibronectin表達(dá)增加。
　　7、PAK5磷酸化E47能促進(jìn)E47入核。
　　結(jié)論：
　　1、PAK5與E47能夠在體內(nèi)外相互作用。
　　2、激酶實(shí)驗(yàn)確定PAK5磷酸化E47的Ser39。
　　3、PAK5磷酸化E47促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。
　　4、PAK5磷酸化E47通過(guò)促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)