自分泌Galectin-3活化的巨噬細胞促進結(jié)腸癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化.pdf

1、研究背景與目的：
　　結(jié)腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移是致使晚期結(jié)腸癌患者預后不良和導致死亡的主要原因之一。結(jié)腸癌細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制一直是科學家們研究的熱點。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）學說在腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移機制的多種假說中較為熱門。該假說提出腫瘤細胞EMT后，侵襲轉(zhuǎn)移能力增強。近年，腫瘤微環(huán)境在腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移中的作用日益受到重視。巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中浸潤較早，數(shù)目較多

2、的免疫細胞，也是微環(huán)境中細胞因子的主要來源。巨噬細胞可塑性強，在不同的細胞因子作用下可以分化為不同的亞型。不同類型的巨噬細胞對腫瘤細胞的作用不同。單核細胞定值于巨噬細胞后，分化成為未活化的巨噬細胞M0,根據(jù)其活化途徑的不同，巨噬細胞可以分為兩大類：M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞發(fā)揮誘發(fā)炎癥反應、吞噬并殺傷腫瘤細胞的作用；M2亞型巨噬細胞則主要抑制炎癥反應，并可促進腫瘤細胞增殖、促進血管新生。以腫瘤相關巨噬細胞為主要代表的

3、腫瘤微環(huán)境也參與了促進腫瘤細胞發(fā)生EMT的過程。微環(huán)境中的多種細胞因子可以誘導腫瘤細胞出現(xiàn)上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變，而腫瘤細胞反過來亦可對其所處的微環(huán)境進行調(diào)控，以適應自身生存。這其中涉及多種細胞成分以及細胞因子，是一個龐大而復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，其中的具體機制至今仍尚未探明。
　　S100A8是鈣離子結(jié)合蛋白S100家族的成員，是一種急性反應蛋白。大量的研究證實其作為一種“損傷模式蛋白”，在機體受到侵害的早期即出現(xiàn)表達升高。在我們前期的實驗中發(fā)

4、現(xiàn)，炎癥相關結(jié)直腸癌小鼠模型中，S100A8的表達增高早于Galectin-3(Gal-3)，且S100A8可以激活巨噬細胞內(nèi)NF-κB通路和PI3K/AKT通路，產(chǎn)生大量細胞因子，影響結(jié)腸癌細胞惡性生物學行為。
　　Galectin-3（Gal-3）是半乳糖凝集素家族成員，廣泛表達于腫瘤細胞和免疫細胞的細胞核、細胞質(zhì)，并可以分泌到細胞外基質(zhì)。在細胞外，Gal-3可以通過與各種免疫細胞表面的聚糖結(jié)合，發(fā)揮刺激細胞因子產(chǎn)生、促進細胞

5、粘附、影響細胞趨化以及凋亡的作用。在細胞內(nèi)Gal-3可以通過參與信號通路調(diào)節(jié)細胞各種生物反應?？梢奊al-3對腫瘤微環(huán)境及腫瘤細胞本身均有一定的作用。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)Gal-3高表達于結(jié)腸癌腫瘤組織和結(jié)腸癌腫瘤間質(zhì)，與結(jié)腸癌遠處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關。但Galectin-3發(fā)揮作用的具體機制尚未探明。在本研究中，我們對Gal-3在結(jié)腸癌中高表達的機制以及其高表達后對腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞和腫瘤細胞又會產(chǎn)生什么影響進行了初步研究。<

6、br>　　研究方法：
　?。?）通過將THP-1細胞予Phorbol-12-myristat-13-acetate(PMA)體外誘導的方法，使其分化成為M0型巨噬細胞，用外源性S100A8重組蛋白刺激巨噬細胞24h后，分別收集細胞總蛋白和培養(yǎng)上清，采用westenblot和ELISA的方法分別檢測阻斷STAT3/IL-6信號通路前后IL-6、Gal-3的表達和STAT3磷酸化水平；分析微環(huán)境中S100A8對巨噬細胞分泌Gal-3的

7、調(diào)節(jié)及其機制。
　?。?）同樣將THP-1細胞體外用PMA誘導成為M0型巨噬細胞，用Gal-3刺激3h、6h、12h、24h、48h后，收集細胞培養(yǎng)上清，采用ELISA方法檢測細胞因子IL-6、IL-12、INF-γ、IL-10、TGF-β表達改變，并與LPS誘導成為的M1型巨噬細胞和IL-4誘導成為的M2型巨噬細胞進行比較，檢測其細胞因子表達的特點；收集Gal-3刺激24小時后的巨噬細胞，流式細胞技術檢測單核巨噬細胞表面特異性標

8、志物CD68和M2型巨噬細胞特異性表面分子CD163的表達，分析Gal-3對巨噬細胞分化的影響。
　　（3）收集外源性Gal-3重組蛋白刺激巨噬細胞24h后的培養(yǎng)上清，與結(jié)腸癌細胞SW480共培養(yǎng)，觀察SW480細胞24h、48h時形態(tài)改變，劃痕實驗測其遷移能力改變，trsanswell法測其侵襲力變化，westenblot方法測SW480細胞EMT相關分子E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Twist的

9、表達，探究經(jīng)Gal-3刺激后的巨噬細胞對結(jié)直腸癌EMT、侵襲、遷移能力的影響。
　?。?）收集共培養(yǎng)后結(jié)腸癌細胞上清，檢測上清中CCL20、CXCL5的表達變化分析微環(huán)境中巨噬細胞對結(jié)腸癌細胞趨化其他免疫細胞的能力可能存在的影響。
　　實驗結(jié)果：
　?。?）Westenblot和ELISA結(jié)果均顯示外源性S100A8蛋白刺激后的巨噬細胞中及培養(yǎng)上清中Gal-3的表達較未處理的巨噬細胞明顯升高，IL-6的表達和STAT3

10、磷酸化水平（p-STAT3）顯著升高，與未處理的巨噬細胞相比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。抑制STAT3通路活性后，使用同等劑量外源性S100A8重組蛋白刺激巨噬細胞，Gal-3的表達與單獨應用S100A8刺激組相比較明顯下調(diào)，但與對照組比較仍有上調(diào)。
　?。?）流式細胞實驗結(jié)果顯示Gal-3刺激后的巨噬細胞CD163表達增高，CD68(+)CD163(+)細胞比例增加，但作用沒有IL-4誘導組顯著。ELISA結(jié)果顯示Ga

11、l-3刺激后的巨噬細胞上清中IL-10、TGF-β、IL-6明顯升高（P<0.05），IFN-γ、IL-12雖較對照組有所升高，但與IL-4刺激組相比較未見明顯差異（P>0.05）。Gal-3誘導后的巨噬細胞分泌細胞因子的表達更接近于IL-4誘導分化的M2型巨噬細胞。
　?。?）Gal-3刺激后巨噬細胞的條件培養(yǎng)基與結(jié)腸癌細胞SW480共培養(yǎng)可誘導SW480細胞出現(xiàn)形態(tài)改變，由橢圓形變?yōu)樗笮?、細胞體積增大、細胞間隙增寬，出現(xiàn)間質(zhì)化

12、改變。Transwell實驗結(jié)果顯示共培養(yǎng)后的SW480細胞穿過基質(zhì)膠透過小室膜的細胞數(shù)明顯高于對照組（P<0.05）。劃痕實驗中共培養(yǎng)之后的SW480細胞遷移能力明顯增強,Western blot檢測共培養(yǎng)后SW480細胞總蛋白中EMT相關蛋白的表達，結(jié)果顯示E-cadherin表達降低，Vimentin、Twist的表達升高，而N-cadherin未見明顯變化。
　?。?）與未用Gal-3刺激的巨噬細胞相比，Gal-3刺激后的

13、巨噬細胞的條件培養(yǎng)基與SW480細胞共培養(yǎng)后，可誘導SW480分泌至培養(yǎng)上清中CCL20和CXCL5的濃度明顯升高。
　　結(jié)論：
　　（1）微環(huán)境中的S100A8可能作為Gal-3的上游調(diào)控因子，可激活巨噬細胞中STAT3/IL-6信號通路上調(diào)Gal-3的表達。
　?。?）微環(huán)境中的Gal-3可以促進巨噬細胞向M2型巨噬細胞分化。
　　（3）Gal-3激活后的巨噬細胞可以通過誘導結(jié)腸癌細胞發(fā)生EMT，增強其侵襲轉(zhuǎn)