苦參素對結(jié)腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響的實驗研究.pdf

1、背景和目的:苦參素是傳統(tǒng)中藥苦參提取的一種生物堿活性成分，近來研究表明它具有廣泛的抗腫瘤作用，然而其在結(jié)腸癌具體的作用機制不清。本研究的目的是探討苦參素在結(jié)腸癌細(xì)胞的作用，闡明其對結(jié)腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及其可能涉及的機制，為中藥單體治療結(jié)腸癌提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞，觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。試驗分為:(1)實驗組:用不同濃度的苦參素(mg/ml)(0.25，0.5，

2、0.75，1，1.25，1.5，1.75，2)處理結(jié)腸癌細(xì)胞。(2)對照組:未經(jīng)藥物處理，僅加入細(xì)胞懸液。(3)空白對照組:未加入細(xì)胞，僅加入細(xì)胞培養(yǎng)液。運用MTT法使用不同濃度的苦參素(mg/ml)(0.25，0.5，0.75，1，1.25，1.5，1.75，2)作用于SW480，RKO，HCT116等結(jié)腸癌細(xì)胞24h后檢測細(xì)胞的增殖活性;不同濃度的苦參素(mg/ml)(0，0.25，0.5，0.75)干預(yù)結(jié)腸癌細(xì)胞RKO24小時后，

3、應(yīng)用細(xì)胞劃痕實驗和Transwell小室模型分別進(jìn)行細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲實驗檢測細(xì)胞遷移、侵襲能力;苦參素干預(yù)之前和干預(yù)之后的結(jié)腸癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的改變由應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察。將結(jié)腸癌細(xì)胞RKO分為四組，即苦參堿素干預(yù)的終濃度分別為0、0.25、0.5、0.75(mg/ml)，應(yīng)用免疫印跡法（Western Blotting）檢測各組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Snail、P65蛋白水平的表達(dá)情況。
　　2.利用

4、基因干擾技術(shù)設(shè)計并合成干擾效率較高的P65shRNA。實驗分為四組，分別是對照組、苦參素組（終濃度0.25mg/ml）、P65shRNA組、苦參素(終濃度0.25mg/ml)+ P65shRNA組，應(yīng)用免疫印跡法(Western Blotting)檢測各組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Snail的蛋白水平表達(dá)情況，應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)改變，應(yīng)用細(xì)胞劃痕實驗和Transwell小室模型分別進(jìn)行細(xì)胞遷移、細(xì)

5、胞侵襲實驗檢測細(xì)胞遷移、侵襲能力。
　　結(jié)果:
　　1.MTT實驗表明苦參素能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，當(dāng)苦參素的干預(yù)濃度在0～2mg/ml范圍時，隨著苦參素干預(yù)濃度的增大，其對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制越明顯。不同濃度的苦參素（mg/ml）(0、0.25、0.5、0.75)作用于結(jié)腸癌RKO細(xì)胞24小時后，各組的遷移距離分別為263.00±25.51，170.25±46.38、103.87±33.90、75.46±20.19。Tr

6、answell小室侵襲實驗中，0mg/ml組、0.25mg/ml組、0.5mg/ml組、0.75mg/ml組中穿過上室的細(xì)胞數(shù)分別是:166±8.89、130.65±10.23、93.60±9.21、62.28±7.07。倒置相差顯微鏡下可見苦參素處理前細(xì)胞呈間質(zhì)樣的細(xì)長梭形，細(xì)胞連接松散;苦參素處理后細(xì)胞呈上皮樣的形態(tài)，細(xì)胞間連接緊密，幾乎看不到偽足。Western Blotting法結(jié)果顯示，0mg/ml組、0.25mg/ml組、0

7、.5mg/ml組、0.75mg/ml組中所對應(yīng)的E-cadherin的蛋白表達(dá)結(jié)果分別為:0.30±0.08、0.48±0.19、0.72±0.13、1.06±0.44; N-cadherin的蛋白表達(dá)結(jié)果分別為:0.50±0.10、0.33±0.09、0.25±0.08、0.18±0.05; Snail的蛋白表達(dá)結(jié)果分別為:0.88±0.04、0.43±0.11、0.33±0.11、0.20±0.07。P65的蛋白水平結(jié)果分別為:0.

8、75±0.03、0.40±0.08、0.34±0.08、0.20±0.06。綜上，隨著苦參素干預(yù)濃度的增大，N-cadherin、Snail、P65的蛋白表達(dá)減少，而E-cadherin的蛋白表達(dá)增加。
　　2.成功設(shè)計、合成出一條干擾效率較高的P65shRNA。對照組、苦參素組、P65shRNA組、苦參素+P65shRNA組中所對應(yīng)的E-cadherin蛋白表達(dá)結(jié)果分別為:0.16±0.01、0.23±0.02、0.33±0.0

9、3、0.5±0.06; N-cadherin的蛋白表達(dá)結(jié)果分別為:0.60±0.04、0.46±0.07、0.32±0.06、0.20±0.05; Snail的蛋白表達(dá)結(jié)果分別為:0.93±0.04、0.71±0.12、0.62±0.10、0.35±0.07。綜上，N-cadherin、Snail的蛋白表達(dá)水平，P65shRNA組的低于苦參堿組，苦參素+P65shRNA均低于苦參素組及P65shRNA組，E-cadherin蛋白表達(dá)水平

10、恰好相反。倒置相差顯微鏡下可見對照組細(xì)胞呈間質(zhì)樣的細(xì)長梭形，大多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)長的絲狀偽足，細(xì)胞連接松散，苦參素組或P65shRNA組較對照組細(xì)胞連接緊密。相對于苦參素組或P65shRNA，苦參素+P65shRNA組細(xì)胞進(jìn)一步呈明顯的上皮樣形態(tài)，細(xì)胞間連接緊密，幾乎看不到偽足，細(xì)胞呈緊密連接的鵝卵石樣改變。空白對照組，苦參素組、P65shRNA、苦參素+P65shRNA組相對應(yīng)的遷移距離分別為297.31±65.91、180.00±50.

11、24、116.84±36.89、59.09±15.36。Transwell小室侵襲實驗中，對照組，苦參素組、P65shRNA組、苦參素+P65shRNA組相對應(yīng)的穿過上室的細(xì)胞數(shù)分別是143.67±10.97、119.33±20.23、97.67±18.77、50.33±8.50。
　　結(jié)論:
　　1.苦參素在體外具有抗結(jié)腸癌細(xì)胞的作用，具體表現(xiàn)在其能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。
　　2.苦參素能影響結(jié)腸癌細(xì)胞