星形膠質(zhì)細(xì)胞通過CX47介導(dǎo)Ca2+-ERK1-2磷酸化通路促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖.pdf

1、隨著我國社會老齡化的程度加劇，神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如阿爾茨海默癥、癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)病率逐漸增加，嚴(yán)重影響了我國老年人口的健康水平和患者家庭的生活質(zhì)量。脫髓鞘是神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的最典型的共有病理表現(xiàn)之一，并且隨著年齡增加，髓鞘再生效率下降。如果提高髓鞘的耐受和再生，可能為治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、保護(hù)神經(jīng)元提供新的途徑。研究髓鞘形成和髓鞘再生本質(zhì)就是研究少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)生與調(diào)控。髓鞘的再生以及修復(fù)，主要依賴于少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(Ol

2、igodendrocyte precursor cell,OPC)大量增殖及遷移到受損軸突區(qū)域，并分化成熟。星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte,AST)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)數(shù)量最多、分布最廣泛的一類細(xì)胞，對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖分化起著重要的調(diào)控作用。有研究表明星形膠質(zhì)細(xì)胞可以為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞提供一個(gè)良好的生長環(huán)境，促進(jìn)其增殖，遷移，分化，對促進(jìn)髓鞘再生具有不可替代的作用。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建星形膠質(zhì)細(xì)胞與少突膠質(zhì)前體細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型，并利用高

3、通量轉(zhuǎn)錄組測序（RNA sequencing，RNA-Seq）分析其不同培養(yǎng)狀態(tài)下基因組改變，旨在尋找促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞大量增殖的靶點(diǎn)及其相應(yīng)代謝機(jī)制，并輔以分子生物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證其代謝通路，為神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的抗脫髓鞘治療提供理論基礎(chǔ)。
　　第一部分
　　1材料與方法：
　　1.1清潔出生的SD乳鼠（1-3d），由重慶醫(yī)科大學(xué)的實(shí)驗(yàn)動物中心提供。體外進(jìn)行原代培養(yǎng)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。并分別用一抗血小板衍生

4、生長因子ɑ受體（ Platelet-derived growth factor-ɑreceptor,PDGFɑR）和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)進(jìn)行標(biāo)記檢測其生物學(xué)特性并分析純度。
　　1.2實(shí)驗(yàn)分為三組：單獨(dú)培養(yǎng)的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞與少突膠質(zhì)前體細(xì)胞于細(xì)胞小室內(nèi)共培養(yǎng)、星形膠質(zhì)細(xì)胞與少突膠質(zhì)前體細(xì)胞直接接觸式共培養(yǎng)，通過倒置相差顯微鏡觀察其不同時(shí)間段生長

5、狀態(tài)并隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照。
　　1.3胸腺嘧啶核苷類似物(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,EDU)對三組少突膠質(zhì)前體細(xì)胞進(jìn)行Apollo染色和DNA染色，通過熒光顯微鏡進(jìn)行檢測并獲得圖像，利用Image J軟件計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)新生細(xì)胞數(shù)目，判斷其增值能力。
　　1.4分離純化三組處于對數(shù)期的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，分析三組細(xì)胞不同培養(yǎng)狀態(tài)下細(xì)胞周期分布。
　　1.5分離純化三組處于對

6、數(shù)期的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞并送華大基因測序公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，分析三組細(xì)胞與增殖相關(guān)差異表達(dá)基因及相關(guān)代謝通路
　　1.6隨機(jī)篩選接觸式培養(yǎng)組差異表達(dá)基因，并采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription-polymerse chain reaction,RT-PCR）分析其與單獨(dú)培養(yǎng)組細(xì)胞的RNA相對表達(dá)量，以驗(yàn)證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。
　　2結(jié)果：
　　2.1少突膠質(zhì)前體細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗

7、原PDGFɑR和GFAP分別標(biāo)記的陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)95％以上。少突膠質(zhì)前體細(xì)胞較小，橢圓形，有2-3級突起，突起細(xì)長；星形膠質(zhì)細(xì)胞與細(xì)胞核較大，胞質(zhì)豐富，突起較粗而多分枝。
　　2.2光鏡觀察結(jié)果表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞可以通過分泌細(xì)胞因子或縫隙連接通訊兩種方式促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖，細(xì)胞數(shù)目增多，在第2-3d明顯，其中，直接接觸式培養(yǎng)組增殖作用最為明顯（P＜0.01）。
　　2.3 EDU染色結(jié)果表明，兩個(gè)共培養(yǎng)組新生少突膠

8、質(zhì)前體細(xì)胞數(shù)目均較單獨(dú)培養(yǎng)組多，有明顯差異，其中直接接觸式共培養(yǎng)組增殖效果最明顯（P＜0.01）。
　　2.4流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometer,FCM）分析結(jié)果表明星形膠質(zhì)細(xì)胞與少突膠質(zhì)前體共培養(yǎng)后細(xì)胞周期處于S期比例增高，以接觸式培養(yǎng)組效果最明顯，代表共培養(yǎng)后星形膠質(zhì)細(xì)胞可以促進(jìn)更多少突膠質(zhì)前體細(xì)胞DNA復(fù)制，促進(jìn)其增殖（P＜0.05）。
　　2.5轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果表明直接接觸式培養(yǎng)組縫隙連接蛋白（Connexi

9、n,CX）CX47表達(dá)明顯上調(diào)，且共培養(yǎng)后差異表達(dá)基因主要與細(xì)胞增殖相關(guān)。（P＜0.01）
　　2.6對RT-PCR結(jié)果中RNA表達(dá)量倍數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，與轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果的RNA差異表達(dá)倍數(shù)相一致，證明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。
　　第二部分
　　1材料與方法：
　　1.1清潔出生的SD乳鼠（1-3d），由重慶醫(yī)科大學(xué)的實(shí)驗(yàn)動物中心提供。體外進(jìn)行原代培養(yǎng)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。并建立共培養(yǎng)模型。實(shí)驗(yàn)分四組：接

10、觸式共培養(yǎng)組、縫隙連接蛋白干擾對照組、縫隙連接CX47干擾組、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)阻斷劑組。并采用 RT-PCR、免疫熒光（immunofluorescence,IF）、蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot,WB）篩選CX47特異性干擾RNA，采用WB檢測ERK1/2阻斷效果。
　　1.2對四組少突膠質(zhì)前體細(xì)胞進(jìn)行Fluo-3染色，流式

11、細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦分析少突膠質(zhì)前體細(xì)胞內(nèi)鈣離子相對含量。
　　1.3 Western-blot分析四組細(xì)胞ERK1/2磷酸化程度。
　　1.4 EDU實(shí)驗(yàn)對四組少突膠質(zhì)前體細(xì)胞進(jìn)行Apollo染色和DNA染色，通過熒光顯微鏡進(jìn)行檢測并獲得圖像，利用Image J軟件計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)新生細(xì)胞數(shù)目，判斷其增值能力。
　　1.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞進(jìn)行吸光度測定，計(jì)算并比較四組少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖活力。
　　1.

12、6分離純化四組處于對數(shù)期的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，分析四組細(xì)胞不同培養(yǎng)狀態(tài)下細(xì)胞周期分布。
　　1.7 Western-blot分析四組細(xì)胞周期蛋白 CyclinA、CyclinD1、CyclinE的表達(dá)量變化。
　　2結(jié)果：
　　2.1 CX47特異性干擾RNA序列為CCGAGAAGACTGTCTTCTT；ERK1/2阻斷劑組ERK1/2磷酸化程度較其他組顯著下降（P＜0.05）。
　　2.2流

13、式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦分析共同表明干擾CX47后鈣離子內(nèi)流減少，熒光值降低（P＜0.05）。
　　2.3 Western-blot結(jié)果表明， CX47干擾組ERK1/2磷酸化下降。（P＜0.01）
　　2.4 EDU實(shí)驗(yàn)和CCK8實(shí)驗(yàn)共同表明CX47干擾組和ERK1/2阻斷劑組新生細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞活力下降，增殖能力降低（P＜0.05）。
　　2.5流式分析結(jié)果表明CX47干擾組和ERK1/2阻斷劑組細(xì)胞周期阻滯于G1期

14、，S期比例顯著減少，（P＜0.05）。
　　2.6 Western-blot結(jié)果表明，CX47干擾組和ERK1/2阻斷劑組S期細(xì)胞周期蛋白CyclinA表達(dá)降低，G1期蛋白CyclinD1、CyclinE表達(dá)量升高(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.星形膠質(zhì)細(xì)胞主要通過分泌細(xì)胞因子和縫隙連接（ Gap junction,GJ）通訊兩種方式以促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖，但后者作用更顯著。
　　2.本研究將分子生

15、物實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)錄組測序相結(jié)合，全面分析了星形膠質(zhì)細(xì)胞與少突膠質(zhì)前體細(xì)胞共培養(yǎng)后促進(jìn)縫隙連接蛋白CX47表達(dá)上調(diào)，并為促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖的關(guān)鍵靶點(diǎn)。
　　3. CX47可以調(diào)控鈣信號，磷酸化ERK1/2，從而促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖。干擾RNA沉默基因CX47后，鈣離子內(nèi)流減少，ERK1/2磷酸化降低，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖能力下降。
　　4、CX47是通過調(diào)控鈣信號通路，升高ERK1/2的磷酸化，改變細(xì)胞相關(guān)周期蛋白表達(dá)，從