PlexinA3介導(dǎo)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(Oligodendrocyteprecursorcells,OPCs)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,CNS)中存在并廣泛分布的一類膠質(zhì)細(xì)胞,它可以分化成熟為少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞,其遷移活動(dòng)對(duì)CNS的發(fā)育、損傷修復(fù)與功能重建,以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病如多發(fā)性硬化(multiplesclerosis,MS)等的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮著非常重要的作用。近年來的研究認(rèn)為CNS損傷修復(fù)過程中神經(jīng)纖維的

2、脫髓鞘反應(yīng)以及髓鞘的修復(fù)與再生障礙是制約神經(jīng)損傷修復(fù)結(jié)局與功能重建的重要原因,而成功的髓鞘修復(fù)與再生則極有可能成為改善這一困難局面的重要環(huán)節(jié)。因此,研究髓鞘的形成機(jī)制與相關(guān)的調(diào)節(jié)因素成為CNS損傷修復(fù)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。眾所周知,CNS髓鞘的形成在胚胎時(shí)期主要是由少突膠質(zhì)細(xì)胞完成,然而在機(jī)體成熟以后,少突膠質(zhì)細(xì)胞是否具有修復(fù)與再生髓鞘的能力尚無確切的結(jié)論。近來的研究發(fā)現(xiàn),由OPCs分化形成的少突膠質(zhì)細(xì)胞(Oligodendrocyte,

3、OL)具有再生和形成髓鞘的能力。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),將OPCs與胚胎脊髓共組織培養(yǎng),OPCs能夠分化形成OL并為新生的神經(jīng)纖維形成髓鞘;在脊髓損傷的研究中發(fā)現(xiàn),OPCs能夠從脊髓的腹側(cè)遷移到背側(cè),部分細(xì)胞能在損傷灶周圍分化形成OL;同樣,在對(duì)MS的研究中也發(fā)現(xiàn),脫髓鞘病灶的周圍有大量NG2染色陽性的OPCs,進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),這些NG2陽性細(xì)胞主要是從室管膜下區(qū)遷移而來;這些研究都有力的提示OPCs的確參與了CNS損傷與修復(fù)的過程,并且很可能

4、在這個(gè)過程中扮演了十分重要的角色。為此,研究OPCs的發(fā)育成熟規(guī)律、遷移機(jī)制以及相關(guān)因素成為闡明上述問題的重要內(nèi)容。
　　眾所周知,細(xì)胞的遷移不僅取決于細(xì)胞本身的特性,而且受眾多環(huán)境因素的影響,如細(xì)胞基質(zhì)蛋白、層粘連蛋白等,環(huán)境中的離子含量變化、甚至pH變化也可能對(duì)細(xì)胞的遷移產(chǎn)生影響。近年來尤其引人關(guān)注的是各種細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞遷移的作用。因?yàn)?環(huán)境因素可以通過多種措施加以控制和調(diào)節(jié),并能在特定的條件下得到穩(wěn)定,而細(xì)胞因子通常需要與特

5、定的細(xì)胞受體結(jié)合,并通過一系列的細(xì)胞內(nèi)過程才能實(shí)現(xiàn),作用的機(jī)制更加復(fù)雜而多變;更為重要的是,細(xì)胞因子的遷移誘導(dǎo)作用具有定向性,信號(hào)過程的傳遞、濃度梯度的變化等均可以造成細(xì)胞的定向遷移。課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn),軸突誘導(dǎo)因子Semaphorins家族成員不僅對(duì)再生軸突的生長(zhǎng)具有誘導(dǎo)作用,而且對(duì)OPCs的遷移也有誘導(dǎo)作用。陳煥然博士的研究發(fā)現(xiàn)Semaphorins家族成員Sema3A對(duì)OPCs遷移具有誘導(dǎo)作用,其作用機(jī)制與RhoG信號(hào)通路相

6、關(guān)分子的變化有關(guān);而對(duì)軸突定向延伸作用更明顯的Sema3F是否也有類似的作用?尚無相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。新近的研究發(fā)現(xiàn)sema3與多種腫瘤細(xì)胞的遷移有關(guān),而此誘導(dǎo)遷移的功能的實(shí)現(xiàn)需要與其受體分子NRP2/plexinA3復(fù)合體共同參與,方能激活相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)鏈,從而誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。既然PlexinA3及神經(jīng)菌毛素2(neuropilin2,NRP2)作為sema3F的特異性受體,介導(dǎo)sema3F的在多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo),在細(xì)胞的遷移活動(dòng)中發(fā)

7、揮重要的調(diào)節(jié)作用,Sema3F對(duì)OPCs是否也具有類似的誘導(dǎo)作用?其作用是否同樣是通過NRP2/plexinA3介導(dǎo),以上問題尚未見類似報(bào)道。作者在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中通過Transwell遷移倉實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),Sema3F的確對(duì)OPCs的定向遷移具有誘導(dǎo)作用。如果能夠在OPCs上發(fā)現(xiàn)plexinA3及其NRP2的表達(dá),無疑對(duì)解釋上述現(xiàn)象并認(rèn)識(shí)OPCs的遷移機(jī)制具有重要意義。因此,我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)以上問題進(jìn)行了研究:首先于體外分離培養(yǎng)及純化OPCs

8、,并誘導(dǎo)其向成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞分化,通過RT-PCR、Westernblot、免疫組化、免疫熒光染色等手段,研究plexinA3在OPCs不同分化階段上的表達(dá)與特點(diǎn);其次,在此基礎(chǔ)上,通過分子生物學(xué)手段調(diào)控plexinA3在OPCs中的表達(dá),觀察plexinA3表達(dá)變化對(duì)Sema3F誘導(dǎo)OPCs遷移的影響,最后從上述研究結(jié)果中,闡明plexinA3在Sema3F誘導(dǎo)OPCs遷移中的作用,為深入研究OPCs定向遷移的機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究結(jié)

9、果如下:
　　第一部分(第二章內(nèi)容):PlexinA3在OPCs不同分化階段的表達(dá)
　　采用振蕩分離法體外分離培養(yǎng)新生大鼠OPCs,并觀察了bFGF及PDGF-AA誘導(dǎo)OPCs增殖與分化的作用,采用NG2、O4及MBP抗體檢測(cè)OPCs不同分化階段細(xì)胞的表達(dá);在此基礎(chǔ)上,通過RT-PCR,Westernblot、免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)并分析plexinA3及NRP2在OPCs不同分化階段細(xì)胞中的表達(dá)與特點(diǎn),主要結(jié)果如下:
　　

10、1.振蕩分離法分離新生大鼠OPCs,方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可靠,獲得的OPCs純度高,通過二次接種培養(yǎng)即可達(dá)到滿足實(shí)驗(yàn)所需純度及數(shù)量的OPCs;bFGF及PDGF-AA能誘導(dǎo)OPCs的增殖與分化,NG2,O4及MBP免疫組化染色可識(shí)別到OPCs不同分化的細(xì)胞階段;
　　2.在OPCs階段,即(NG2+染色陽性階段)及未成熟階段(即O4+染色陽性階段),plexinA3高表達(dá),當(dāng)OPCs分化成熟為OL后(即MBP+染色陽性階段)其表達(dá)明顯

11、下調(diào)。作為協(xié)同受體的NRP2在OPCs分化過程中的表達(dá)特點(diǎn)與plexinA3類似;但從Westernblot及RT-PCR等方法的檢測(cè)結(jié)果觀察,在OPCs各分化階段,NRP2的表達(dá)水平較plexinA3稍高,推測(cè)可能與其具有結(jié)合多種協(xié)同受體的特殊功能有關(guān);
　　3.PlexinA3及NRP2均主要表達(dá)于OPCs及未成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜及突起上,提示二者可能OPCs的誘導(dǎo)遷移有關(guān)。
　　第二部分(第三章內(nèi)容):plexi

12、nA3對(duì)sema3F誘導(dǎo)OPCs遷移的影響
　　第一部分研究證實(shí)plexinA3及NRP2表達(dá)在OPCs的細(xì)胞膜及細(xì)胞突起上,并均出現(xiàn)在OPCs階段及未成熟階段,故推測(cè)其可能參與了Sema3F介導(dǎo)的OPCs遷移的調(diào)控。為此,本部分實(shí)驗(yàn)擬通過siRNA干擾技術(shù)調(diào)節(jié)plexinA3及NRP2在OPCs中的表達(dá)水平,通過干擾其表達(dá)后觀察Sema3F誘導(dǎo)OPCs遷移的改變,從而證實(shí)plexinA3在sema3F誘導(dǎo)OPCs遷移中的作用。首

13、先分別設(shè)計(jì)了plexinA3及NRP2的siRNA,利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)plexinA3siRNA及NRP2siRNA對(duì)OPCs生存能力的影響,確認(rèn)其無細(xì)胞毒性后,采用RT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)兩種siRNA的干擾效果,達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求后,利用脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染技術(shù),將plexinA3siRNA及NRP2siRNA分別轉(zhuǎn)染OPCs,通過Transwell遷移倉實(shí)驗(yàn),比較下調(diào)plexinA3及NRP2表達(dá)后,sema3F誘導(dǎo)OPCs遷移的變化,藉

14、此闡明plexinA3及NRP2在OPCs遷移中的作用。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.MTT試驗(yàn)結(jié)果證實(shí),使用合成的plexinA3siRNA及NRP2siRNA濃度在0.125~2.00μg/μl范圍內(nèi)對(duì)OPCs沒有明顯的細(xì)胞毒性作用;
　　2.脂質(zhì)體介導(dǎo)plexinA3siRNA及NRP2siRNA轉(zhuǎn)染OPCs后,通過TR-PCR檢測(cè),二者能分別有效地抑制OPCs表達(dá)plexinA3及NRP2,其抑制效率可達(dá)64~79％;

15、
　　3.Trenswell遷移倉實(shí)驗(yàn)證實(shí)Sema3F對(duì)OPCs具有誘導(dǎo)遷移作用,加入plexinA3siRNA后,OPCs的遷移率明顯降低,加入NRP2siRNA后,OPCs的遷移率下降更加明顯,兩者相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示NRP2-siRNA的抑制效果更加明顯。
　　以上結(jié)果說明,sema3F對(duì)于OPCs具有誘導(dǎo)遷移作用,plexinA3及NRP2作為sema3F誘導(dǎo)作用的協(xié)同受體共同參與了其對(duì)OPCs遷移過程的調(diào)控,相