星形膠質(zhì)細(xì)胞通過Cx47上調(diào)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞S1PR3的表達(dá)并促進(jìn)其增殖.pdf

1、神經(jīng)退行性疾病是一類慢性、進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的總稱。其發(fā)病率高、病期長、并且缺乏特異性治療方法與措施。該類疾病給個人、家庭、社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)與社會負(fù)擔(dān)的雖然這類疾病的病變部位及原因各不相同,但髓鞘產(chǎn)生不同程度破壞或發(fā)生脫髓鞘病變是它們的共同點(diǎn)。主要表現(xiàn)為伴隨著少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendrocyte，OL）的減少以及脫髓鞘。雖然對于這類疾病有很多的研究，少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷和再生修復(fù)的的具體機(jī)制依然不清楚。
　　少突膠質(zhì)

2、細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)唯一的髓鞘形成細(xì)胞。其前體細(xì)胞-少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligodendrocyte progenitor cell，OPC）具有良好的增殖能力，能在體內(nèi)增殖、遷移，最后形成成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞，為髓鞘形成發(fā)揮極其重要的作用。無論內(nèi)源性誘導(dǎo)還是外源性移植，如何獲取大量的OPC，或者促進(jìn)OPC再生成為治療脫髓鞘疾病的關(guān)鍵。我們前期發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes，AST）與OPC在接觸共培養(yǎng)的條件下促進(jìn)其增殖，但具體調(diào)

3、控增殖的機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)探討了ASTs影響OPCs增殖的具體機(jī)制。為治療脫髓鞘疾病提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)與理論基礎(chǔ)。
　　本研究分為以下三個部分：
　　第一部分：星形膠質(zhì)細(xì)胞通過Cx47促進(jìn)OPCs增殖
　　本部分通過使用星形膠質(zhì)細(xì)胞與OPC不同的培養(yǎng)方式，利用細(xì)胞流式、EdU檢測細(xì)胞周期及增殖。采用二代測序分析了不同培養(yǎng)條件下所有的差異基因，篩選有效的差異基因Cx47。構(gòu)建有效的Cx47 siRNA，WB、PCR檢測

4、Cx47蛋白基因變化，細(xì)胞流式檢測細(xì)胞周期、EdU檢測細(xì)胞增殖情況。
　　主要結(jié)果如下：
　　1.OPCs與ASTs直接接觸共培養(yǎng)后，光鏡、流式、EdU檢測顯示ASTs促進(jìn)OPCs增殖較單獨(dú)培養(yǎng)組與上清培養(yǎng)組更明顯，處于細(xì)胞周期S期細(xì)胞比例明顯增加（P＜0.05），新生細(xì)胞數(shù)目占總細(xì)胞數(shù)比例顯著增加（P＜0.001）。
　　2.OPCs與ASTs直接接觸共培養(yǎng)中，Cx47促進(jìn)了OPCs增殖。
　　3.干擾Cx47

5、后，Cx47蛋白與基因表達(dá)明顯下降（P＜0.001），細(xì)胞周期阻滯（P＜0.01），增殖能力降低（P＜0.001）。
　　上述結(jié)果說明ASTs促進(jìn)OPCs的增殖可能通過直接接觸的Cx47。
　　第二部分：星形膠質(zhì)細(xì)胞通過Cx47促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞S1PR3表達(dá)誘導(dǎo)其增殖
　　在證實(shí)接觸共培養(yǎng)更能促進(jìn)OPCs增殖的前提下，我們進(jìn)一步比較了共培養(yǎng)與單獨(dú)培養(yǎng)條件下下游膜信號的變化，利用接觸式共培養(yǎng)組差異表達(dá)基因GO細(xì)胞組分

6、分析，顯示主要位于細(xì)胞外基質(zhì)、胞外區(qū)、細(xì)胞膜。以G-protein coupled receptor activity聚類分析顯示，在S1PRs家族中表達(dá)三個亞型，S1PR1、S1PR3、S1PR5，尤以S1PR3在接觸共培養(yǎng)組較單獨(dú)OPCs培養(yǎng)組差異性最為顯著。本部分在ASTs與OPCs接觸共培養(yǎng)與單獨(dú)培養(yǎng)的條件下，進(jìn)一步檢測了Cx47影響少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖的機(jī)制，流式、共聚焦檢測Cx47干擾后Ca2+的表達(dá)，WB、PCR檢測下游的

7、S1PR3表達(dá)，流式檢測細(xì)胞周期。EdU檢測細(xì)胞增殖情況。利用S1PR3的拮抗劑后，WB檢測了S1PR3，EdU檢測細(xì)胞增殖情況。
　　主要結(jié)果如下：
　　1.Cx47干擾后，流式檢測Ca2+濃度下降（P＜0.05），與共聚焦結(jié)果一致（P＜0.001）。
　　2.下游受體信號的變化以 S1PRs家族在共培養(yǎng)與單獨(dú)培養(yǎng)差異最為顯著，尤以S1PR3最為明顯。
　　3.干擾Cx47后S1PR3的蛋白表達(dá)下降（P＜0.0

8、01）、基因表達(dá)下降（P＜0.01）。
　　4.拮抗S1PR3后，相比單獨(dú)培養(yǎng)組，在共培養(yǎng)組 OPCs細(xì)胞周期G1期阻滯（P＜0.05），EdU檢測新生細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)比例下降（P＜0.001）。
　　以上結(jié)果表明OPCs與ASTs接觸共培養(yǎng)中，Cx47觸發(fā)Ca2+內(nèi)流，上調(diào)S1PR3的表達(dá)調(diào)控OPCs的增殖。
　　第三部分：ASTs通過上調(diào)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞S1PR3激活ERK/p21通路誘導(dǎo)其增殖
　　本部分在

9、ASTs與OPCs接觸共培養(yǎng)與單獨(dú)培養(yǎng)的條件下，主要探討了Cx47調(diào)控S1PR3表達(dá)促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖的下游通路。S1PR3拮抗后，WB檢測了ERK1/2、p-ERK1/2、p21的蛋白變化。PCR檢測了Id4的變化。EdU檢測細(xì)胞增殖。
　　主要結(jié)果如下：
　　1.S1PR3拮抗后，p-ERK1/2降低（P＜0.001），p21表達(dá)增高（P＜0.05），細(xì)胞增殖能力下降（P＜0.001）。
　　2.ERK1/2