槲皮素對(duì)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞缺氧缺糖損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察槲皮素(Quercetin,QUE)對(duì)體外培養(yǎng)的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)缺氧缺糖(oxygen/glucose deprivation，OGD)損傷的保護(hù)作用，并探討PI3K/Akt信號(hào)通路是否參與此過(guò)程。
　　 方法：(1)新生1dSprague-Dawley(SD)大鼠大腦皮質(zhì)混合膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)8d后，采用恒溫?fù)u床振蕩分離法和差速貼壁法純化培養(yǎng)細(xì)

2、胞，3d后行A2B5免疫細(xì)胞熒光染色和DAPI染色對(duì)細(xì)胞及純度進(jìn)行鑒定。(2)純化的OPCs培養(yǎng)3d后，選用2mmol/LNa2S2O4聯(lián)合低糖培養(yǎng)基建立細(xì)胞OGD模型，分別于損傷0.5h、1h和1.5h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)存活率；流式細(xì)胞Annexin FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；透射電鏡觀察損傷細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。(3)觀察QUE對(duì)培養(yǎng)3d后的OPCs存活率的影響，實(shí)驗(yàn)分為Control組、1μ

3、mol/LQUE組、3μmol/LQUE組、9μmol/LQUE組、27μmol/LQUE組、81μmol/LQUE組和100μmol/LQUE組，QUE處理細(xì)胞12h后CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)存活率。(4)觀察QUE共孵育和預(yù)孵育對(duì)OGD損傷的OPCs保護(hù)作用，QUE共孵育法為2mmol/LNa2S2O4聯(lián)合低糖培養(yǎng)基損傷OPCs的同時(shí)加入QUE;QUE預(yù)孵育法為QUE預(yù)處理OPCs3h后撤除QUE并行OGD損傷，以上損傷時(shí)間均為1.

4、5h；兩種孵育方法中OPCs均被分為七組即Control組；OGD組；OGD+QUE組，QUE終濃度分別為1μmol/L、3μmol/L、9μmol/L、27μmol/L和81μmol/L;CCK-8法檢測(cè)OPCs相對(duì)存活率，LDH試劑盒檢測(cè)LDH漏出量。(5)觀察QUE共孵育對(duì)OGD損傷的OPCs保護(hù)作用，將OPCs分為Control組；OGD組；OGD+QUE組，QUE終濃度為3-81μmol/L，以E損傷時(shí)間均為1.5h；Hoec

5、hst33258染色檢測(cè)OPCs核濃染率、流式細(xì)胞AnnexinFITC/PI雙染法檢測(cè)OPCs凋亡情況；Western blotting法檢測(cè)凋亡及存活相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3和p-Akt)的表達(dá)。(6)為進(jìn)一步觀察PI3K/Akt信號(hào)通路是否參與此保護(hù)過(guò)程，將OPCs分為Control組；OGD組；OGD+81μmol/LQUE組和OGD+81μmol/LQUE+LY294002組，以上損傷時(shí)

6、間均為1.5h;Western blotting法檢測(cè)p-Akt的表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)細(xì)胞免疫熒光鑒定顯示大多數(shù)細(xì)胞為A2B5陽(yáng)性其純度達(dá)98.14％。(2)2mmol/LNa2S2O4聯(lián)合低糖培養(yǎng)基處理OPCs，形態(tài)學(xué)觀察顯示OGD損傷0.5h，大部分細(xì)胞突起回縮，胞體變圓，折光性下降，隨損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，OPCs逐漸脫壁，1.5h時(shí)只有少數(shù)貼壁細(xì)胞。CCK-8法檢測(cè)顯示損傷0.5h、1h和1.5h組細(xì)胞的存活率顯著降低，

7、與Control組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；損傷1.5h組細(xì)胞存活率與0.5h組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。Annexin FITC/PI雙染法檢測(cè)顯示，與Control組相比損傷0.5h、1h和1.5h組的存活細(xì)胞相對(duì)數(shù)量均顯著降低；而早期和晚期凋亡細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量均顯著增加；損傷1.5h組的存活細(xì)胞相對(duì)數(shù)量與0.5h組和1h組相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。OPCs損傷1.5h后，電鏡結(jié)果顯示細(xì)胞線粒體腫脹

8、，有些細(xì)胞胞核固縮成塊，細(xì)胞器破碎。(3)CCK-8法檢測(cè)1-100μmol/L的QUE對(duì)正常生長(zhǎng)的OPCs相對(duì)存活率的影響，與Control組相比結(jié)果顯示100μmol/L的QUE孵育OPCs12h后，細(xì)胞相對(duì)存活率顯著降低（P＜0.01），1-81μmol/L的QUE用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(4)CCK-8法檢測(cè)QUE共孵育和預(yù)孵育對(duì)OGD損傷的OPCs保護(hù)作用，結(jié)果顯示：3μmol/L、9μmol/L、27μmol/L和81μmol/L的Q

9、UE共孵育能顯著提高OGD損傷的OPCs相對(duì)存活率，與OGD組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），且相同濃度下共孵育比預(yù)孵育保護(hù)效果明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。LDH試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示：3μmol/L、9μmol/L、27μmol/L和81μmol/L的QUE共孵育能顯著降低OGD損傷的OPCsLDH漏出量，與OGD組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，且相同濃度下共孵育比預(yù)孵育保護(hù)效果明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)籌異(P＜0.05)。(

10、5)QUE共孵育處理OGD損傷的OPCs后，Hoechst33258核染色結(jié)果顯示3-81μmol/L的QUE能降低核濃染OPCs的相對(duì)數(shù)量，與OGD組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），且隨QUE濃度增加核濃染OPCs相對(duì)數(shù)量逐漸降低。Annexin FITC/PI雙染法檢測(cè)顯示：3-81μmol/L的QUE能抑制OGD損傷的OPCs早期凋亡細(xì)胞相對(duì)數(shù)量，與OGD組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），且隨QUE濃度增加早期凋亡細(xì)胞相對(duì)

11、數(shù)量逐漸降低。(6)Westernblotting結(jié)果顯示：3-81μmol/L的QUE共孵育能顯著降低Bax和cleaved-caspase-3的表達(dá)，提高Bcl-2和p-Akt的水平，與OGD組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），且隨QUE濃度增加Bax和cleaved-caspase-3的表達(dá)量逐漸降低，而Bcl-2和p-Akt的表達(dá)量逐漸增多。當(dāng)用P13K特異性抑制劑LY294002預(yù)處理OPCs2h后，與OGD+81μmol/