CXCL12-CXCR4對(duì)大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞遷移的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：
　　脊髓損傷(SCI)目前缺乏有效的治療手段，主要困難有:殘存神經(jīng)細(xì)胞的存活、軸突再生、殘存軸突的再髓鞘化、再生軸突的生長(zhǎng)方向不確定、以及如何重新構(gòu)建有功能的軸突聯(lián)系。SCI大部分是不完全橫斷損傷，但是在物理和化學(xué)作用下，局部缺血、缺氧，損傷區(qū)域可能進(jìn)入多種炎性因子，細(xì)胞死亡和凋亡等級(jí)聯(lián)效應(yīng)被觸發(fā)，可以造成殘存神經(jīng)系統(tǒng)的繼發(fā)性損傷。損傷脊髓局部因此普遍存在殘存軸突脫髓鞘的病理改變，有些患者在數(shù)十年后，軸突脫髓鞘變化仍

2、然存在，使殘存軸突不能發(fā)揮作用。這些不利因素一直困擾著醫(yī)學(xué)工作者。
　　在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和損傷修復(fù)過(guò)程中，作為少突膠質(zhì)細(xì)胞主要來(lái)源的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(Oligodendrocyte Precursor Cells，OPCs)在一系列信號(hào)（如PDGF、netrin-1）誘導(dǎo)下可以遷移到相應(yīng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突，然后分化成成熟的髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)揮中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和損傷修復(fù)的功能。大量研究表明:趨化因子及其受體在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的

3、遷移中發(fā)揮重要作用。并且已有研究表明，CXCL12可以通過(guò)CXCR4調(diào)控OPCs的遷移、增殖和分化來(lái)促進(jìn)損傷脊髓的修復(fù)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，但也有研究發(fā)現(xiàn)CXCL12/CXCR4不能調(diào)控OPCs的遷移。而在膽管癌細(xì)胞和成熟樹(shù)突細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CXCL12/CXCR4可以通過(guò)AKT和MEK1/2通路調(diào)控其存活和趨化性。目前CXCL12/CXCR4對(duì)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞遷移的影響研究還遠(yuǎn)未明晰，且其機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CXCL

4、12/CXCR4對(duì)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞遷移的影響及AKT和MEK1/2通路在其中的重要角色，以期為脊髓損傷修復(fù)提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.利用振蕩分離和差速貼壁等方法分離、培養(yǎng)新生48 h的SD大鼠大腦皮層組織中的OPCs，并根據(jù)OPCs表面標(biāo)記PDGFR-α及成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記O4、MBP三個(gè)指標(biāo)進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定分離的OPCs及誘導(dǎo)分化中期和晚期的成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞。
　　2.通過(guò)boyden cham

5、ber小室檢測(cè)在不同濃度的CXCL12(0 ng/ml、5 ng/ml、10ng/ml、20 ng/ml)作用下對(duì)大鼠OPCs處理48h后其遷移能力的變化，利用Westernblotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相應(yīng)條件下CXCR4及MEK1/2與PI3K通路中ERK、p-ERK、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)的變化。
　　3.通過(guò)CXCR4shRNA抑制大鼠OPCs中CXCR4蛋白表達(dá)，利用Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CXCL12(2

6、0 ng/ml)作用條件下大鼠OPCs中CXCR4及MEK1/2與PI3K通路蛋白ERK、p-ERK、AKT和p-AKT表達(dá)的變化。利用boyden chamber小室檢測(cè)相應(yīng)條件下大鼠OPCs遷移能力的變化。
　　4.分別通過(guò)LY294002阻斷PI3K通路、U0126阻斷MEK1/2通路、LY294002和U0126同時(shí)阻斷PI3K和MEK1/2通路，利用Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CXCL12(20ng/ml)作

7、用條件下大鼠OPCs中MEK1/2和PI3K通路蛋白ERK、p-ERK、AKT和p-AKT表達(dá)的變化，通過(guò)boyden chamber小室檢測(cè)大鼠OPCs遷移能力的變化。
　　結(jié)果：
　　1.利用振蕩分離和差速貼壁等方法可以大量獲得原代OPCs，其胞體呈近圓形，
　　胞體周?chē)哂欣w細(xì)的兩極或三極細(xì)胞突起，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示上述方法分離的原代OPCs特異性表達(dá)PDGFR-α，比例達(dá)95％。OPCs經(jīng)誘導(dǎo)成成熟少突

8、膠質(zhì)細(xì)胞后，誘導(dǎo)中期O4表達(dá)呈陽(yáng)性，其胞體呈圓形，胞體周?chē)w細(xì)突起增多;誘導(dǎo)晚期MBP表達(dá)呈陽(yáng)性，細(xì)胞周?chē)泻芏嗬w細(xì)的突起，向四周放射呈網(wǎng)狀。
　　2.OPCs在不同濃度的CXCL12作用下處理48h后，隨著CXCL12濃度的提高
　　大鼠OPCs的遷移能力逐漸增強(qiáng)，CXCL12濃度為20 ng/mL時(shí)促進(jìn)作用最明顯(p＜0.05)，達(dá)到對(duì)照組的3.64倍。Western bLotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:CXCR4、p-ERK

9、、p-AKT蛋白表達(dá)隨著CXCL12濃度的提高逐漸增加，CXCL12濃度為20 ng/ml時(shí)增加最明顯(p＜0.05);而ERK、AKT蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯的變化(p＞0.05)。
　　3.通過(guò)CXCR4shRNA抑制CXCR4蛋白表達(dá)后，與對(duì)照組相比，CXCL12(20ng/ml)對(duì)大鼠OPCs遷移的促進(jìn)作用受到明顯抑制(P＜0.05)，并且PI3K和MEK1/2通路蛋白ERK和AKT磷酸水平也受到明顯抑制(P＜0.05，P＜0.

10、05)。
　　4.分別用LY294002阻斷PI3K通路和U0126阻斷MEK1/2通路，與對(duì)照組相比，CXCL12對(duì)大鼠OPCs遷移的促進(jìn)作用均受到明顯抑制（P＜0.05，P＜0.05）;LY294002和U0126同時(shí)阻斷PI3K和MEK1/2通路后，與對(duì)照組相比，CXCL12對(duì)大鼠OPCs遷移的促進(jìn)作用受到更加明顯的抑制（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.本研究通過(guò)振蕩分離和差速貼壁等方法可以大量獲得原代OP