DNA甲基化對(duì)CXCL12-CXCR4生物學(xué)軸基因調(diào)控的影響及機(jī)制.pdf

1、研究背景： 在哺乳動(dòng)物中，DNA的甲基化主要通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1，DNMT3A和DNMT3B來建立和維持，這三種酶之間存在著協(xié)同作用。 研究目的： 研究趨化因子CXCL12及其受體CXCR4在星形細(xì)胞瘤和乳腺癌組織中的表達(dá)與腫瘤惡性程度之間的關(guān)系；初步探討CXCL12基因的啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化與mRNA表達(dá)變化的內(nèi)在因果聯(lián)系；探討DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)與DNA異常甲基化之間的關(guān)系；分析DNA甲基化在CX

2、CL12/CXCR4生物軸參與星形細(xì)胞瘤和乳腺癌惡性進(jìn)展中的調(diào)控機(jī)制。 研究方法： （一）星形細(xì)胞瘤中DNA甲基化對(duì)CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸的基因調(diào)控 1．臨床收集76例腦星形細(xì)胞瘤和10例正常腦組織標(biāo)本，收集患者的臨床和病理資料。 2．傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和實(shí)時(shí)定量PCR方法，檢測(cè)CXCL12、CXCR4 mRNA在星形細(xì)胞瘤和正常腦組織中的表達(dá)情況。采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)、M

3、ann-Whitney檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析CXCL12、CXCR4 mRNA表達(dá)與腫瘤病理組織分級(jí)、患者性別和年齡等臨床參數(shù)間的關(guān)系。 3．DNA經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾后，甲基化特異性PCR方法，檢測(cè)CXCL12基因在星形細(xì)胞瘤和正常腦組織中的DNA甲基化發(fā)生情況。采用卡方檢驗(yàn)分析CXCL12基因甲基化與腫瘤病理組織分級(jí)、患者性別和年齡等臨床參數(shù)間的關(guān)系；另外分析CXCL12基因甲基化與CXCL12 mRNA表達(dá)之間的關(guān)系。

4、4．傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和實(shí)時(shí)定量PCR方法，檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B基因在星形細(xì)胞瘤和正常腦組織中的mRNA表達(dá)情況。采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)分析DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達(dá)相互之間的相關(guān)性；另外分析DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）表達(dá)與CXCL12基因甲基化的關(guān)系。 （二）乳腺癌中DNA甲基化對(duì)CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸的基因調(diào)控 1．臨床收

5、集63例乳腺癌標(biāo)本和20例正常乳腺組織標(biāo)本，收集患者的臨床和病理資料。 2．免疫組織化學(xué)染色-SP法，檢測(cè)ER、PR、Her-2、p53和Ki-67蛋白在乳腺癌和正常乳腺組織中的表達(dá)情況。 3．傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和實(shí)時(shí)定量PCR方法，檢測(cè)CXCL12、CXCR4 mRNA在乳腺癌和正常乳腺組織中的表達(dá)情況。采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)、Mann-Whitney檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析CXCL12、CXCR4 m

6、RNA表達(dá)在不同年齡、絕經(jīng)情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、病理類型、腫瘤大小以及不同免疫組化指標(biāo)等臨床參數(shù)間的關(guān)系。 4．DNA經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾后，甲基化特異性PCR方法，檢測(cè)CXCL12基因在乳腺癌和正常乳腺組織中的DNA甲基化發(fā)生情況。采用卡方檢驗(yàn)分析CXCL12基因甲基化在不同年齡、絕經(jīng)情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、病理類型、腫瘤大小以及不同免疫組化指標(biāo)等臨床參數(shù)間的關(guān)系；另外分析CXCL12基因甲基化與CXCL12mRNA

7、表達(dá)之間的關(guān)系。 5．傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和實(shí)時(shí)定量PCR方法，檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B基因在乳腺癌和正常乳腺組織中的mRNA表達(dá)情況。采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)分析DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達(dá)相互之間的相關(guān)性；另外分析DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)與CXCL12基因甲基化的關(guān)系。 6．免疫組織化學(xué)染色-SP法，檢測(cè)CXCL12、CXCR4蛋白在乳腺癌和正常乳腺

8、組織中的表達(dá)情況。采用卡方檢驗(yàn)分析CXCL12、CXCR4蛋白在不同年齡、絕經(jīng)情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、病理類型、腫瘤大小以及不同免疫組化指標(biāo)等臨床參數(shù)間的關(guān)系；另外分析CXCL12蛋白表達(dá)與CXCL12基因甲基化之間的關(guān)系。 研究結(jié)果： （一）星形細(xì)胞瘤中DNA甲基化對(duì)CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸的基因調(diào)控 1．實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示，星形細(xì)胞瘤標(biāo)本CXCR4 mRNA表達(dá)量高于正常腦組織。CXC

9、R4 mRNA表達(dá)量與組織分級(jí)呈正相關(guān)。CXCR4 mRNA在不同性別、不同年齡組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2．實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)CXCL12 mRNA在16例星形細(xì)胞瘤表達(dá)下調(diào)或缺失，在47例星形細(xì)胞瘤表達(dá)上調(diào)。CXCL12 mRNA在Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤的表達(dá)高于正常腦組織。Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)星形細(xì)胞瘤CXCL12 mRNA表達(dá)，與正常腦組織之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，CXCL12 mRNA在不同性別、不同年齡組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、意義。 3．CXCL12基因在星形細(xì)胞瘤中的DNA甲基化率為34．2％。在26例發(fā)生甲基化星形細(xì)胞瘤中，21例是不完全甲基化，5例是完全甲基化。所有10例正常腦組織中均未檢測(cè)到CXCL12基因甲基化。CXCL12基因在Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤的甲基化率為55．0％，Ⅲ級(jí)為34．6％，Ⅳ級(jí)為20．0％。CXCL12基因甲基化率與星形細(xì)胞瘤WHO分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。CXCL12基因甲基化在不同性別、不同年齡組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4．實(shí)

11、時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示，在星形細(xì)胞瘤中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B基因表達(dá)相互之間呈正相關(guān)，DNMT1和DNMT3A、DNMT1和DNMT3B、DNMT3A和DNMT3B。DNMT1、DNMT3A和DNMT3B基因在CXCL12發(fā)生甲基化的星形細(xì)胞瘤表達(dá)均高于CXCL12未發(fā)生甲基化的星形細(xì)胞瘤。 （二）乳腺癌中DNA甲基化對(duì)CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸的基因調(diào)控 1．實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示，在乳

12、腺癌中CXCR4 mRNA表達(dá)水平（1．22±0．80）高于正常乳腺組織（0．65±0．59，P=0．001）。CXCR4 mRNA在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目（>3個(gè)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）、Her-2表達(dá)情況（3+）密切相關(guān)（P直分別為0．013、0．031）。 2．實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示，在乳腺癌中CXCL12 mRNA表達(dá)水平（1．41±1．18）低于正常乳腺組織（2．02±0．71，P=0．031）。CXCL12

13、mRNA在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目（>3個(gè)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）、ER表達(dá)情況（0，1+，2+）密切相關(guān)（P直分別為0．017、0．047）。但CXCL12 mRNA在不同年齡、絕經(jīng)情況、組織學(xué)分級(jí)、病理類型、腫瘤大小以及其他免疫組化指標(biāo)（PR、Her-2、p53和Ki-67）組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。 3．乳腺癌CXCR4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為79．4％。所有20例正常乳腺組織CXCR4蛋白均陰性表達(dá)。CXCR4蛋

14、白高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目（>3個(gè)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）密切相關(guān)（P=0．035）。 乳腺癌CXCL12蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為38．1％。所有20例正常乳腺組織CXCL12蛋白均陽(yáng)性表達(dá)。乳腺癌CXCL12蛋白表達(dá)在不同患者年齡、絕經(jīng)情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、組織學(xué)分級(jí)、病理類型、腫瘤大小以及不同免疫組化指標(biāo)（ER、PR、Her-2、p53和Ki-67）組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。 4．CXCL12基因在乳腺癌中的DNA甲基

15、化率為52．4％。所有20例正常乳腺組織中均未檢測(cè)到CXCL12基因甲基化的發(fā)生。在33例發(fā)生甲基化的乳腺癌中，20例為不完全甲基化，13例為完全甲基化。乳腺癌CXCL12基因甲基化狀態(tài)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目（>3個(gè)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）、ER表達(dá)情況（0，1+，2+）密切相關(guān)（P值分別為0．032、0．011）。乳腺癌CXCL12基因甲基化狀態(tài)與CXCL12 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0．568，P=1．2×10-6），與CXCL12蛋白表達(dá)水

16、平亦呈負(fù)相關(guān)（P=0．001）。 5．實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，在乳腺癌中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表達(dá)相互之間呈正相關(guān)，DNMT1和DNMT3A（r=+0．272，P=0．031），DNMT1和DNMT3B（r=+0．303，P=0．016）、DNMT3A和DNMT3B（r=+0．389，P=0．002）。DNMT1、DNMT3B基因在CXCL12發(fā)生甲基化乳腺癌的mRNA表達(dá)高于CXCL12未發(fā)生甲基化乳

17、腺癌（P值分別為0．012、0．026）。但DNMT3A mRNA表達(dá)在CXCL12發(fā)生甲基化組和CXCL12未發(fā)生甲基化組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0．185）。 研究結(jié)論： 1．在部分星形細(xì)胞瘤中（主要是低度惡性星形細(xì)胞瘤），CXCL12基因通過DNMTs參與的DNA甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)。CXCR4受體在星形細(xì)胞瘤中過表達(dá)與星形細(xì)胞瘤惡性程度呈正相關(guān)。 2．趨化因子CXCL12及其受體CXCR4在Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞