5aza-C對菊花DNA甲基化及基因表達(dá)的影響.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)采用0、100、200、400μM四個濃度的5-氮雜胞苷(5-azaC)溶液分別對菊花品種“泉鄉(xiāng)沖天”室外苗進(jìn)行在體處理。觀察記錄葉片形狀、植株高度和開花時(shí)間，測定生理指標(biāo)葉綠素和丙二醛的含量。應(yīng)用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)和高效液相色譜(HPLC)檢測各樣本基因組DNA甲基化比例及模式。分析菊花表型變化與基因組DNA甲基化變化的關(guān)系。利用cDNA擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(cDNA-AFLP)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，從而嘗試揭示DN

2、A甲基化對于菊花生長發(fā)育及基因表達(dá)的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　(1)表型:5-azaC處理30天后，和對照相比葉片發(fā)生卷曲。除此之外，菊花植株發(fā)生矮化，四組材料之間株高均有顯著性差異，而且有劑量累加效應(yīng)。去處理20天后，100μM處理組株高恢復(fù)和對照相近，200、400μM處理組恢復(fù)較慢，依然和對照有顯著差異。開花時(shí)間和5-azaC的濃度相關(guān)，但不是規(guī)律性的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。四種濃度處理組的開花時(shí)間均有差異，和對照相比，100μ

3、M和200μM處理組花期分別提前9天和16天左右，并且，待三組菊花完全開放時(shí)，觀察花型沒有差異，說明5-azaC的處理沒有影響其觀賞價(jià)值。400μM處理組花期推遲3天左右。這表明高濃度的5-azaC有抑制作用。
　　(2)生理指標(biāo)檢測:表型的變化和生理反應(yīng)密切相關(guān)，所以本實(shí)驗(yàn)對相關(guān)的生理指標(biāo)進(jìn)行了檢測。各樣本葉綠素含量:100μM、200μM葉綠素含量稍高于對照組，400μM含量最少。丙二醛含量:400μM處理組丙二醛含量最高、其

4、它三組相當(dāng)。由此看來，低濃度的5-azaC對菊花的生理反應(yīng)影響不大，高濃度的5-azaC對細(xì)胞有一定的傷害。
　　(3)甲基化水平檢測:以濃度為100、200、400μM的甲基化抑制劑5-azaC處理和未處理的菊花葉片基因組為材料，利用MSAP和HPLC技術(shù)對基因組DNA甲基化變化進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，各處理組甲基化水平均有所降低，并且隨著5-azaC濃度的增加，甲基化降低的幅度也增加，而降低的趨勢趨于平緩。
　

5、　(4)基因差異表達(dá)分析:以濃度為100、200、400μM的甲基化抑制劑5-azaC處理和未處理的菊花葉片總RNA為材料，利用cDNA-AFLP技術(shù)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。結(jié)果顯示，24對引物組合擴(kuò)增出772條轉(zhuǎn)錄衍生片段(TDF)，各處理組與對照相比均有差異表達(dá)條帶，其中100μM處理組上調(diào)表達(dá)條帶25個;200μM處理組上調(diào)表帶的條帶30個;400μM處理組上調(diào)表達(dá)的條帶22個。選取提前開花組100-400bp之間的16條片段進(jìn)行克