干旱脅迫下咖啡酸對黃瓜基因組DNA甲基化的影響及一個甲基化差異基因的功能分析.pdf

1、非生物脅迫如干旱、低溫一直都是對植物影響較大的自然災(zāi)害。黃瓜作為我國主要栽培蔬菜之一，具有葉片大、根系淺等特點，需水量大且對水分反應(yīng)特別敏感。干旱是夏、秋季節(jié)黃瓜育苗生產(chǎn)中存在的主要問題，因此探明干旱脅迫對黃瓜生長的影響以及緩解脅迫的方法對黃瓜的栽培和生長具有重要意義。本實驗探究了外源咖啡酸(CA)緩解黃瓜幼苗干旱脅迫的機制，研究了外源CA對干旱脅迫下黃瓜幼苗生理生化的相關(guān)指標(biāo)及基因組DNA甲基化的影響，并分離了干旱脅迫下CA誘導(dǎo)的DN

2、A甲基化差異片段，然后進一步對這些差異片段進行克隆及測序。本文旨在從宏觀、微觀、生理和分子水平上揭示外源CA緩解干旱和低溫脅迫的機制，為生產(chǎn)中科學(xué)應(yīng)用CA及黃瓜耐干旱栽培提供更多的理論和實踐依據(jù)。外源過氧化氫(H2O2)緩解干旱脅迫時分離得到兩個甲基化差異基因，本課題利用絕對熒光定量PCR技術(shù)分析了兩個基因的表達情況，此外還利用黃瓜授粉后外源基因直接導(dǎo)入技術(shù)將其中的一個基因轉(zhuǎn)入黃瓜，利用PCR檢測獲得陽性植株，進而對該基因做了初步的功能

3、分析。為深入闡明黃瓜對逆境脅迫的響應(yīng)機理打下基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:
　　(1)外源CA緩解干旱脅迫時對黃瓜幼苗生長量、抗氧化酶及其相關(guān)指標(biāo)的影響
　　干旱脅迫明顯導(dǎo)致了“津春四號”黃瓜幼苗生長指標(biāo)的下降，而用外源CA預(yù)處理黃瓜幼苗，其生長量顯著增加。所以，干旱脅迫嚴(yán)重影響了黃瓜幼苗的正常生長，而外源CA處理能夠緩解干旱的抑制作用。
　　在本實驗中，干旱脅迫使黃瓜幼苗葉片的丙二醛(MDA)和內(nèi)源H2O2含量以及02·-

4、的產(chǎn)生速率高于對照。但用外源CA預(yù)處理后再進行干旱脅迫時增強了葉片的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)和谷胱甘肽還原酶(GR)等抗氧化物酶的活性，提高了抗氧化物抗壞血酸(AsA)和還原型谷胱甘肽(GSH)的含量、以及脯氨酸和可溶性糖的含量，從而降低了葉片中MDA和

5、內(nèi)源H2O2的產(chǎn)生速率。我們推斷，外源CA預(yù)處理提高了黃瓜葉片抗氧化酶的活性，減少了活性氧含量，進而減輕了干旱脅迫對葉片膜系統(tǒng)的傷害。這一推斷利用熒光定量在基因表達水平上進一步得到驗證。
　　(2)外源CA處理對干旱脅迫下黃瓜基因組DNA甲基化的影響
　　通過對黃瓜葉片基因組DNA進行甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)分析，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫影響黃瓜葉片中基因組DNA的甲基化水平。外源CA預(yù)處理會使其DNA甲基化狀態(tài)進一步發(fā)生改變。

6、
　　(3)外源H2O2誘導(dǎo)的干旱處理下兩個甲基化差異基因HG-1和HG-2的表達及HG-2的功能分析
　　干旱下外源H2O2誘導(dǎo)的甲基化差異基因HG-1表達量在根、第二片真葉及第一片真葉均呈現(xiàn)H2O2+PEG處理組低于PEG處理組的趨勢，而在莖和子葉中該基因的表達量與在根、第二片真葉及第一片真葉中的相反。黃瓜幼苗不同組織部位中的甲基化差異基因HG-2的表達量在H2O2+PEG處理組均低于PEG處理組，表明在干旱脅迫下經(jīng)H2

7、O2誘導(dǎo)后該基因“下調(diào)”表達。
　　利用PCR技術(shù)克隆HG-2基因全長的cDNA序列，將獲得的全長序列與含有35s啟動子的pBI121載體重組，構(gòu)建反義表達載體，轉(zhuǎn)化黃瓜，用PCR方法鑒定獲得轉(zhuǎn)反義基因陽性植株。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)反義HG-2基因的植株比野生型表現(xiàn)出對干旱更強的耐受性，且其內(nèi)源H2O2水平明顯降低，GPX、GR、GSH-Px、DHAR和MDHAR等抗氧化物酶的活性顯著增強，抗氧化物AsA和GSH的含量也顯著升高，初步表明