脂肪細胞通過CXCL12-CXCR4信號通路促進破骨細胞的分化和功能.pdf

1、目的：本實驗旨在探討脂肪細胞對破骨細胞分化及其功能活性的影響，解析其可能的分子機制。
　　方法：ST2小鼠間充質(zhì)干細胞成脂誘導21天，分化后的ST2-脂肪細胞于無血清α-MEM中培養(yǎng)14小時后收集其培養(yǎng)上清。收集后的脂肪細胞培養(yǎng)上清與α-MEM以1:1比例混合制成脂肪細胞條件培養(yǎng)基（ADIPO CM），ELISA檢測ADIPO CM中趨化因子CXCL12含量。Cell Counting Kit-8（CCK-8）實驗分析CXCL12

2、對單核巨噬細胞（RAW264.7）和骨髓巨噬細胞（BMMs）增殖活性的影響。將RAW264.7細胞接種于含有RANKL的培養(yǎng)基，BMMs接種于含有RANKL和M-CSF的培養(yǎng)基中，行破骨細胞分化誘導實驗。根據(jù)培養(yǎng)基中加入或不加入CXCL12、AMD3100，將破骨細胞分化實驗分為4組：對照組（CONTROL）、脂肪細胞條件培養(yǎng)基組（ADIPO CM）、CXCL12組和AMD3100組，培養(yǎng)第4天進行TRAP染色并計數(shù)TRAP陽性的多核破

3、骨細胞。在培養(yǎng)第7天，進行van kossa染色并分析破骨細胞功能活性。qRT-PCR及Western blot分別檢測破骨細胞NFAT2，src，MMP-9，CK以及黏附分子（β3 integrin, CD44, OPN）mRNA和蛋白表達水平。
　　結果： ELISA檢測結果顯示，脂肪細胞上清中含有大量CXCL12。CCK-8實驗結果顯示外源性加入CXCL12（20 ng/ml,50 ng/ml or100 ng/ml）不影響

4、RAW264.7細胞和BMMs的增殖活性。TRAP染色及破骨細胞功能活性檢測發(fā)現(xiàn)脂肪細胞上清可以促進破骨細胞的分化以及其功能活性。加入CXCL12蛋白后，TRAP陽性多核破骨細胞數(shù)量增加，破骨細胞骨吸收面積增加。而AMD3100處理后脂肪細胞上清的促進作用明顯受到抑制。Western blot及qRT-PCR結果發(fā)現(xiàn)脂肪細胞上清以及外源性加入CXCL12均可以促進NFAT2，src，MMP-9，CK以及破骨細胞黏附相關分子如β3 int