地西他濱抑制破骨細(xì)胞分化及其功能.pdf

1、本文主要從以下兩個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 不同濃度梯度地西他濱對破骨細(xì)胞形成的影響
　　目的：本實(shí)驗(yàn)旨在用不同濃度梯度地西他濱處理破骨前體細(xì)胞RAW246.7后，觀察不同濃度梯度地西他濱對破骨細(xì)胞形成的影響。同時(shí)檢測不同濃度梯度地西他濱處理對破骨前體細(xì)胞RAW246.7細(xì)胞的核因子-kB受體活化因子（RANK）表達(dá)量的影響，探討RANK的表達(dá)是否成藥物劑量依賴型。
　　方法：不同濃度梯度的地西他濱處理RAW246

2、.7后，通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度的地西他濱對RAW246.7細(xì)胞的毒性作用；同時(shí)用核因子-kB受體活化因子配體（RANKL）誘導(dǎo)4-5天，經(jīng)抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色后，觀察TRAP陽性（核≥3）細(xì)胞的形成；Q-PCR和 Western Blot分別檢測不同藥物濃度下RANK在mRNA水平和蛋白水平上的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：地西他濱抑制RANKL誘導(dǎo)RAW246.7細(xì)胞形成TRAP陽性多核細(xì)胞,同時(shí)也抑制了RANK在m

3、RNA水平和蛋白水平的表達(dá)，且隨著藥物濃度的增高，上述的抑制作用越明顯。
　　結(jié)論：低濃度的地西他濱對RAW246.7細(xì)胞無明顯的毒性作用；隨著地西他濱濃度的增高，對破骨細(xì)胞形成的抑制作用越明顯，且對RANK的抑制作用也成劑量依賴型。
　　第二部分 地西他濱抑制破骨細(xì)胞分化及其功能
　　目的：地西他濱(5-雜氮-2，-脫氧胞苷酸，達(dá)珂)是一種 DNA甲基化抑制劑，作為腫瘤化療藥物在臨床上主要用于治療骨髓發(fā)育不良綜合征（

4、MDS）和急性髓細(xì)胞白血病（AML）。本實(shí)驗(yàn)旨在用地西他濱處理破骨前體細(xì)胞RAW246.7后，觀察地西他濱對RAW246.7向破骨細(xì)胞分化的影響，同時(shí)檢測核因子-kB受體活化因子（RANK）的表達(dá)量，探討地西他濱對RAW246.7向破骨細(xì)胞分化的影響是否與RANK—RANKL軸有關(guān)。
　　方法：在體外，地西他濱處理RAW246.7后，用核因子-kB受體活化因子配體（RANKL）誘導(dǎo)4-5天，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，觀察

5、TRAP陽性（核≥3）細(xì)胞的形成；用骨板吸收實(shí)驗(yàn)檢測破骨細(xì)胞的活性；抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒檢測細(xì)胞中TRAP酶的活性；Q-PCR檢測破骨細(xì)胞特異性標(biāo)志基因抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、組織蛋白酶K（CK）和金屬基質(zhì)蛋白酶-9（MMP-9）mRNA表達(dá)量；Q-PCR、Western Blot分別檢測RANK在mRNA水平和蛋白水平上的表達(dá)。在體內(nèi)，地西他濱處理C57/BL小鼠后，用TRAP ELISA試劑盒檢測小鼠血清中TRAP酶的活

6、性；采用卵巢去勢的方法建立骨質(zhì)疏松模型，用地西他濱處理后斷頸處死，取其股骨通過Micro CT掃描來觀察地西他濱在動物體內(nèi)的作用。
　　結(jié)果：地西他濱抑制RANKL誘導(dǎo)RAW246.7細(xì)胞形成TRAP陽性多核細(xì)胞，并抑制破骨細(xì)胞的活性，下調(diào)了破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因TRAP、CK和MMP-9的mRNA表達(dá)，同時(shí)也抑制了RANK在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。在體內(nèi)，地西他濱降低C57/BL小鼠血清中TRAP5b酶的活性；Micro CT