高頻低強度復(fù)合振動抑制破骨細(xì)胞分化的作用及機制.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)退化為特征,以致骨的脆性增高而骨折危險性增加的一種全身性系統(tǒng)性代謝性骨病。據(jù)估計,全球范圍內(nèi)現(xiàn)有2億多OP患者,其中亞洲地區(qū)成為OP高發(fā)地區(qū),中國患者已超過9000萬。目前OP在世界常見病、多發(fā)病中居第7位。OP導(dǎo)致的骨折等并發(fā)癥可致殘、致死,治療耗資大,給患者、家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。隨著人口老年化,這情況顯得更為突出。OP不僅是一個醫(yī)療問題,也是一個需要迫切

2、關(guān)注的社會問題。當(dāng)前對OP的藥物治療以抑制骨吸收為主,少數(shù)藥物可以促進(jìn)骨形成,但效果都不確切,且藥物治療存在較大副作用。Wolff定律認(rèn)為,骨的結(jié)構(gòu)特點是適應(yīng)功能需要而鑄造的,并隨著功能需要的改變而進(jìn)行重建；骨的功能是承受活動期間骨組織的機械應(yīng)變,并隨著功能需要所產(chǎn)生的應(yīng)力的變化而進(jìn)行功能適應(yīng)性重建；骨組織內(nèi)骨細(xì)胞接受到的變化著的應(yīng)力是這種重建的原始動力。而低于引起骨組織損傷的機械振動信號具有很強的成骨效應(yīng),它不僅可防止骨丟失,還可以改

3、善骨結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能。因此,振動療法是一種具有無創(chuàng)、副作用小的非藥物治療OP的新型模式。
　　 振動作為一種力學(xué)刺激,需要一定的頻率和強度才能有效傳遞至成骨效應(yīng)細(xì)胞誘發(fā)成骨反應(yīng),過低的強度和頻率難以到達(dá)有效部位或不能成為誘發(fā)成骨的閾上刺激,而過高的振動強度對人體是有危害的。骨對機械信號很敏感,研究證明短時間的振動能通過降低骨吸收,促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化,提高成骨速度,增加松質(zhì)骨量而提高骨的數(shù)量和質(zhì)量。振動的成骨效應(yīng)已經(jīng)形成共

4、識,但其具體的機制尚不清楚。目前主要有骨血灌注,骨功能適應(yīng)和振動在骨組織的傳導(dǎo)等觀點,其確切的信號傳導(dǎo)通路也不清楚。振動在改善骨質(zhì)量的同時還可在一定程度上預(yù)防或改善肌萎縮,維持或增強肌力,有助于改善或增強平衡能力。目前短時高頻低強度的振動用于OP相關(guān)研究已得到廣泛關(guān)注。為了能更好的適合人體解剖學(xué)特點,我們改良全身垂直振動方式研究設(shè)計了復(fù)合振動儀,希望在改變振動方式的同時保持振動的成骨效應(yīng)。其特點在于:1、產(chǎn)生自然的交替運動模式:振動過程

5、中人體姿勢被動處于輕微不平衡狀態(tài),患者必須積極主動調(diào)節(jié)姿勢維持身體平衡,進(jìn)而使患者骨盆產(chǎn)生一個交替的上下晃動運動訓(xùn)練。骨盆的這種交替的上下晃動運動模式是人體行走和跑動的動作基礎(chǔ),因此復(fù)合振動給人體提供了一個符合人體解剖學(xué)特點的訓(xùn)練刺激；2、復(fù)合振動時人體反復(fù)地姿態(tài)調(diào)節(jié)維持身體平衡,增大了肌肉的收縮力度,強化了神經(jīng)一肌肉系統(tǒng)的參與并加大了對骨組織的力學(xué)刺激,在一定程度上加強了人體的平衡能力訓(xùn)練；3、復(fù)合振動是在垂直振動基礎(chǔ)之上,增強神經(jīng)肌

6、肉系統(tǒng)在振動過程中的參與,更強調(diào)神經(jīng)肌肉系統(tǒng)在防治OP中的作用。課題組早期得出的研究結(jié)果主要有:1、振動頻率對成骨細(xì)胞細(xì)胞周期、增殖能力、堿性磷酸酶活性均有影響,實驗研究表明振動促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及分化的適宜頻率為15～45Hz；2、一定的復(fù)合振動可以增加去勢大鼠的骨密度,改善骨微結(jié)構(gòu)、提高骨強度；3、復(fù)合振動在改善骨質(zhì)量的同時還可在一定程度上預(yù)防或改善肌萎縮,維持或增強肌力,減輕或改善外周末梢神經(jīng)功能退變,可能有助于改善或增強平衡能力。

7、雖然復(fù)合振動在成骨細(xì)胞和動物層次得到很好的成骨效應(yīng),但對唯一引起骨吸收的破骨細(xì)胞尚未進(jìn)行研究?？傊?機械振動信號是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò),其具體的作用機制還需要進(jìn)一步研究。
　　 骨重建是一個骨組織自我更新的過程:破骨細(xì)胞不斷吸收舊骨,成骨細(xì)胞則不斷形成新骨補充骨吸收部分。當(dāng)骨骼成熟后,破骨細(xì)胞在骨重建過程中維持骨量穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。破骨細(xì)胞增多或活性增強,導(dǎo)致骨吸收增加,骨重塑失衡,導(dǎo)致很多骨骼系統(tǒng)疾病的發(fā)生,如:OP,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎

8、,轉(zhuǎn)移性骨腫瘤。破骨細(xì)胞來源于造血干細(xì)胞單核巨噬細(xì)胞系,由多核巨噬細(xì)胞組成,主要分布在骨質(zhì)表面、骨內(nèi)血管通道周圍,具有特殊的骨吸收功能,在人體生理性骨重建和病理性骨破壞過程中發(fā)揮重要作用。因破骨細(xì)胞屬于終末細(xì)胞,不能分化傳代,分離純化困難,限制了對破骨細(xì)胞功能的深入研究。RAW264.7細(xì)胞是小鼠源性破骨細(xì)胞前體細(xì)胞,來自Abelson小鼠白血病病毒所致的腫瘤,代表破骨細(xì)胞分化的早期階段。核因子-κB受體活化因子配體(receptor

9、activator ofNF-κB ligand,RANKL)/RANK/骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)調(diào)節(jié)軸的發(fā)現(xiàn),讓我們對破骨細(xì)胞及其骨生理作用的認(rèn)識更加深入。隨著對破骨細(xì)胞分化調(diào)控機制的深入認(rèn)識,RANKL在破骨細(xì)胞分化、成熟和活化過程中的作用備受關(guān)注。RANKL與破骨細(xì)胞前體表面上的RANK結(jié)合為破骨細(xì)胞的分化成熟提供了關(guān)鍵的信號。RANKL能誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化,因此RAW264.7細(xì)胞被

10、廣泛用于破骨細(xì)胞分化研究。
　　 高頻低強度復(fù)合振動(low-magnitude,high-frequency compound vibration,LMHFCV)的成骨效應(yīng)是否就是成骨細(xì)胞效應(yīng)的結(jié)果,還是存在破骨細(xì)胞效應(yīng)的成分?研究振動對破骨細(xì)胞分化的影響就能更好地闡述振動防治OP的機制。因此,本課題擬使用LMHFCV直接作用于破骨細(xì)胞前體RAW264.7細(xì)胞,觀察振動對破骨細(xì)胞分化成熟的影響,從而為振動防治OP機制提供進(jìn)一步

11、的解釋。
　　 目的：
　　 1、觀察LMHFCV對RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分化的影響。
　　 2、探討LMHFCV對破骨細(xì)胞特異性基因組織蛋白酶K(cathepsin K,CATK)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase-9,MMP-9)及抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)表達(dá)的影響。
　　 3、

12、探討LMHFCV對c-Fos蛋白的影響。
　　 方法：
　　 1、LMHCV對RAW264.7細(xì)胞分化的影響。
　　 傳代細(xì)胞以3×103/孔的密度接種于有200μl完全培養(yǎng)基的96孔板中,第2天更換為10％FBS-CS培養(yǎng)基,RANKL組及LMHFCV組加入1μl RANKL(10μg/ml),使其終濃度為50ng/ml,LMHFCV組加予LMHFCV刺激(45 Hz,0.3g,15分/天,1次/天),誘導(dǎo)培養(yǎng)

13、4d,每3 d換一次液。誘導(dǎo)培養(yǎng)4 d后,細(xì)胞進(jìn)行TRAP染色后進(jìn)行觀察。按試劑盒說明書配制TRAP染色液,并進(jìn)行染色,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況、形態(tài)及生長狀態(tài),并拍照記錄。
　　 2、LMHFCV對破骨細(xì)胞特異性基因CATK、MMP-9及TRAP表達(dá)的影響
　　 傳代細(xì)胞以1×105/孔的密度接種于有2ml完全培養(yǎng)基的6孔板中,第2天更換為10％FBS-CS培養(yǎng)基,RANKL組及LMHFCV組加入10μl RA

14、NKL(10μg/ml),使其終濃度為50ng/ml,LMHFCV組加予LMHFCV刺激(45 Hz,0.3g,15分/天,1次/天),共誘導(dǎo)培養(yǎng)3d。誘導(dǎo)培養(yǎng)3d后,多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real—timeRT-PCR)分析破骨細(xì)胞特異性基因CATK、MMP-9及TRAP的表達(dá)。收集細(xì)胞,用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,進(jìn)行總RNA反轉(zhuǎn)錄,最后在AB1l7500PCR儀上用SYBR(R)Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行real-

15、time RT-PCR檢測CATK,MMP-9和TRAP mRNA表達(dá),以甘油醛-3一磷酸脫氫酶(glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)對照,分析CATK,MMP-9和TRAP基因相對表達(dá)量的變化。
　　 3、LMHFCV對c-Fos蛋白表達(dá)的影響。
　　 傳代細(xì)胞以1×105/孔的密度接種于直徑3.5cm的培養(yǎng)皿,培養(yǎng)液定量為2ml,第2天更換為10％FBS-CS

16、培養(yǎng)基,RANKL組及LMHFCV組加入10μl RANKL(10μg/ml),使其終濃度為50ng/ml,LMHFCV組加予LMHFCV刺激(45 Hz,0.3g,15分/天,1次/天),共誘導(dǎo)培養(yǎng)3d。誘導(dǎo)培養(yǎng)3d后,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,免疫印跡法(western blot)檢測c-Fos蛋白表達(dá),以GAPDH為內(nèi)對照,分析c-Fos相對表達(dá)量的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、LMHFCV抑制RAW264.7細(xì)

17、胞向破骨細(xì)胞分化。
　　 誘導(dǎo)培養(yǎng)4d后進(jìn)行TRAP染色,對照組未見TRAP染色陽性多核細(xì)胞,而RANKL組明顯出現(xiàn)許多TRAP染色陽性多核細(xì)胞(≥3核),即破骨細(xì)胞(P<0.001)。但是LMHFCV組TRAP染色陽性多核細(xì)胞(≥3核)明顯較RANKL組少(P=0.002)。同時還發(fā)現(xiàn)LMHFCV組TRAP染色陽性多核巨細(xì)胞(≥10核)較RANKL組明顯減少(P<0.001)。
　　 2、LMHFCV抑制破骨細(xì)胞特異性

18、基因CATK、MMP-9及TRAP表達(dá)。
　　 誘導(dǎo)培養(yǎng)3d后,real—time RT-PCR分析破骨細(xì)胞特異性基因CATK,MMP-9和TRAP的表達(dá)。與對照組比,RANKL明顯促進(jìn)基因CATK,MMP-9和TRAP的表達(dá)(P<0.001)。但是LMHFCV明顯抑制RANKL促進(jìn)破骨細(xì)胞基因表達(dá)的作用(P<0.01)。
　　 3、LMHFCV抑制c-Fos蛋白表達(dá)。
　　 誘導(dǎo)培養(yǎng)3d后,western bl