整合素β1在細(xì)胞因子誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中的作用及其機(jī)制.pdf

1、骨組織的變化在很大程度上是由兩種骨細(xì)胞聯(lián)合作用的，即成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞是主要負(fù)責(zé)新骨形成，而破骨細(xì)胞則負(fù)責(zé)清除骨化組織。他們的形成和活動(dòng)受到多種激素和細(xì)胞因子的嚴(yán)格控制。干擾這些細(xì)胞能形成許多病理骨狀況。特別是在成人骨骼疾病中，如骨關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，破骨細(xì)胞活動(dòng)異常。促炎分泌物如TNF-α、IL-6產(chǎn)生于病理骨組織中，并逐漸調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活動(dòng)，促進(jìn)疾病發(fā)展，因此靶向抑制這些促炎癥分泌物的對(duì)于疾病的治療至關(guān)重要。最近的研究進(jìn)

2、展顯示了腫瘤壞死因子受體(TNFR)/TNF樣蛋白質(zhì)的重要性:骨保護(hù)素(OPG)，核因子激活受體(RANK)和RANK配體(RANKL)共同調(diào)控破骨細(xì)胞功能。目前的研究表明RANKL或TNF-α聯(lián)合巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MCSF)能從骨髓巨噬細(xì)胞體外引起破骨細(xì)胞生成，但機(jī)制不完全清楚。所以，進(jìn)一步闡明RANKL或TNF-α信號(hào)通路生理和病理的調(diào)整，對(duì)于骨溶解的臨床干預(yù)治療具有重要的意義。
　　整合蛋白是介導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞及細(xì)胞和基質(zhì)間

3、相互作用的異二聚體受體，他們?cè)谄乒羌?xì)胞分化和活化中起到重要作用。破骨細(xì)胞的表達(dá)的整合蛋白經(jīng)分析確定至少有三種主要的集成類型——α5β3，α5β1，α2β1。盡管α5β3整合蛋白在破骨細(xì)胞生成中有至關(guān)重要的作用，其他的類型仍然未知。但考慮到大部分都涉及到整合蛋白β1，通過整合蛋白β1可以分析其他亞類型和整合蛋白β1參與破骨細(xì)胞分化的作用。
　　α腫瘤壞死因子（TNF-α）是一種主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，并參與正常炎

4、癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。α腫瘤壞死因子在許多病理狀態(tài)下產(chǎn)生增多，包括敗血癥、惡性腫瘤、心臟衰竭和慢性炎性疾病。在重癥類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的血液及關(guān)節(jié)中都可發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子增多。在本研究中TNF-α具有誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的重要作用。而研究中另外一種具有誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的重要作用的因子為RANKL，RANKL全稱為Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand（核因子κB受體活化因子配體），又名為TNF-

5、related activation-induced cytokine(TRANCE)，TNF相關(guān)激活誘導(dǎo)細(xì)胞因子;osteoprotegerin ligand(OPGL)，骨保護(hù)素配體osteoclast differentiation factor(ODF)，破骨細(xì)胞分化因子。為避免不同命名在學(xué)術(shù)上引起不便，美國骨礦研究學(xué)會(huì)(ASBMR)將其標(biāo)準(zhǔn)化命名為RANKL。其在成骨細(xì)胞中表達(dá)(osteoblast)，激活破骨細(xì)胞。RANKL

6、過表達(dá)，可導(dǎo)致一系列骨疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病性關(guān)節(jié)炎等相關(guān)疾病。
　　雖然RANKL和TNFα誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的作用是已知的，但是其具體的作用機(jī)制還不完全清楚，尤其是TNFα的機(jī)制，報(bào)道很少。TNFα誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的下游信號(hào)傳導(dǎo)通路沒有一致的研究結(jié)論。然而，我們?cè)絹碓蕉嗟淖C據(jù)證實(shí)了在TNFα作用時(shí)和整合素β1作用密切相關(guān)。
　　因此，本項(xiàng)目擬研究整合素β1在細(xì)胞因子誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中的作用及其機(jī)制。我們首先構(gòu)建了整

7、合素β1沉默表達(dá)細(xì)胞系，用RNA干擾技術(shù)進(jìn)行整合素β1的基因敲除，成功構(gòu)建了所需要的細(xì)胞系。然后通過這種細(xì)胞系，探索整合素β1是對(duì)破骨細(xì)胞分化是否具有作用。我們用兩種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，分別為RANKL和TNF-α。在兩種誘導(dǎo)劑處理組中，結(jié)果明顯不同。在TNF-α誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成中，穩(wěn)定的敲除整合素β1后，TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而RANKL處理組中，TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量沒有顯著變化。為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果，我們做了破骨細(xì)

8、胞陷窩形成實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和TRAP陽性檢測(cè)結(jié)果類似，TNF-α誘導(dǎo)后，整合素β1敲除組陷窩形成顯著下降，RANKL處理后，未見顯著變換。最后，我們對(duì)破骨細(xì)胞分化的標(biāo)志性基因Cathespinκ和Osterix進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，同樣的，在TNF-α誘導(dǎo)后，整合素β1敲除組中Cathespinκ和Osterix的表達(dá)都顯著降低，而RANKL處理后，兩種基因的表達(dá)未發(fā)現(xiàn)顯著變化。以上結(jié)果表明，在TNF-α誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的過程中，整合素β1

9、起著重要的作用，它可以促進(jìn)這一分化過程，而在RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的過程中，整合素β1則沒有這一作用。
　　為了闡明整合素β1在破骨細(xì)胞分化中的分子機(jī)制，我們進(jìn)一步研究與破骨細(xì)胞分化有關(guān)的信號(hào)通路的變化，我們選擇了三種信號(hào)通路，NF-κB信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、JNK信號(hào)通路。分別應(yīng)用RANKL，TNF-α作用于細(xì)胞，檢測(cè)兩種因子作用下對(duì)照組與整合素β1敲除組之間NF-κB、MAPK以及JNK三種信號(hào)通路中關(guān)鍵因子的變化。

10、在TNF-α作用的反應(yīng)中，整合素β1敲除組MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵因子p38激酶磷酸化明顯減少，而NF-KB和JNK信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子均沒有顯著變化。相比之下，在RANKL作用下，對(duì)照組和整合素β1敲除組NF-κB、MAPK以及JNK三種信號(hào)通路中各關(guān)鍵因子均沒有發(fā)生顯著變化。這一結(jié)果提示我們，在TNF-α誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中，整合素β1的作用可能與MAPK信號(hào)通路有一定關(guān)系。為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，我們用MAPK抑制劑作用于β1敲

11、除組細(xì)胞，仍然分別用RANKL和TNF-α進(jìn)行誘導(dǎo)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制MAKP后，只在TNF-α處理的β1敲除組中觀察到破骨細(xì)胞分化顯著降低。令人驚訝的是，盡管在RANKL處理中我們也增加了MAPK抑制劑，但是沒有顯示破骨細(xì)胞分化顯著減少。通過推測(cè)，這意味著與TNF-α誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成相比，MAPK信號(hào)通路在RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞中的作用很小。而以上結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了，在TNF-α誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中，整合素β1的作用與MAPK信號(hào)

12、通路有關(guān)。
　　最后，我們又應(yīng)用了整合素β1抑制劑進(jìn)行作用，分為空白對(duì)照組，2.5μg/mL組和5.0μg/mL組，結(jié)果顯示，在RANKL處理中，破骨細(xì)胞分化數(shù)量沒有顯著變化，而在TNF-α處理時(shí)，整合素β1抑制劑組破骨細(xì)胞分化數(shù)量顯著下降，而且5.0μg/mL組比2.5μg/mL組破骨細(xì)胞數(shù)量下降更加顯著。這一結(jié)果進(jìn)一步證明了整合素β1在TNF-α誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化過程中起著重要的促進(jìn)作用，而且提示我們這種促進(jìn)作用和整合素β1的

13、含量呈現(xiàn)一個(gè)正相關(guān)。同樣，我們用MAPK激酶抑制劑做相同的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果整合素β1抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，在RANKL處理中，破骨細(xì)胞分化數(shù)量沒有顯著變化，而在TNF-α處理時(shí)，整合素β1抑制劑組破骨細(xì)胞分化數(shù)量顯著下降，而且5.0μg/mL組比2.5μg/mL組破骨細(xì)胞數(shù)量下降更加顯著。這也進(jìn)一步說明了MAPK信號(hào)通路在TNF-α在誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的過程中起著重要作用，抑制此通路可以減少破骨細(xì)胞分化。
　　總之，我們的研究結(jié)果表明，整合